实验原理

多重免疫组化(multiplex Immunohistochemistry, mIHC):即不受限于一抗种属，可以实现一个样品同时多轮标记多种染料的染色方法。该技术利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），催化后续加入到体系的非活性荧光素（酪胺-荧光基团偶联物），荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。

技术优势

1. 与传统免疫组化和免疫荧光相比，mIHC最大的优势即是可以在同一样品上实现无限次的染料叠加；

2. 单个靶标标记时间短，仅需2h，即可实现对靶标蛋白的高特异性标记；

3.TSA系统信号放大效果更强，对低丰度蛋白的检测效果更好。

实验步骤

（以石蜡切片为例）

预处理：石蜡切片脱蜡

第一个循环：（染料标记）

（1）抗原修复：将抗原修复液倒入修复缸中，微波 100%功率加热煮沸，放入玻片，加热，随后取出冷却至室温；

（2）抗原封闭：除去残存液体，滴加抗原封闭液，室温孵育；

（3）一抗孵育：除去残存液体，滴加稀释后的一抗，室温孵育（或 4℃过夜），用TBST浸洗三次；

（4）二抗孵育：除去残存液体，滴加二抗，室温孵育 ，用 TBST 浸洗三次；

（5）荧光标记：除去残存液体，滴加荧光染料工作液，室温孵育，用 TBST 浸洗三次；

至此，第一个染料（即第一个靶标蛋白）标记完成；而后按照上述1-5步骤所述，进行下一个染料（靶标蛋白）的标记。最后进行DAPI 复染及封片。

转自：精英汇科研服务

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