目前仍需要提高灵敏度和通量的直接蛋白测序技术。

2023年11月13日，中国科学院化学研究所吴海臣及中国科学院高能物理研究所刘蕾共同通讯（张云和尹雅琨为共同第一作者）在Nature Methods（IF=48）在线发表题为“Peptide sequencing based on host-guest interaction-assisted nanopore sensing”的研究论文，该研究提出了一种基于酶裂解和主-客体相互作用辅助纳米孔传感的肽测序替代方法。

偶然发现，在含有苯丙氨酸的肽的特定位置上，任何蛋白原氨基酸的身份都可以通过在胍环[7]脲存在的情况下通过α-溶血素纳米孔转运时的电流阻塞来确定。在此基础上，进一步提出了肽测序的概念验证演示，通过羧基肽酶从肽的C端依次切割氨基酸，然后用纳米孔中的肽探针确定它们的身份和序列。随着未来的优化，该研究指出了一种基于纳米孔的蛋白质测序的不同方法。

蛋白质在生物体中发挥着广泛的功能，包括DNA复制、催化代谢反应、充当信使、维持适当的pH值和液体平衡，以及为细胞和生物体提供结构。它们由长链氨基酸组成，其序列由基因的核苷酸序列决定，通常导致蛋白质折叠成特定的三维结构，这决定了它们的活性；然而，基因序列并不直接编码有关蛋白质丰度、翻译后修饰或剪接的信息，即使蛋白质初级序列的细微变化也会造成有害影响。因此，一种高效、经济的蛋白质测序和鉴定翻译后修饰的策略是蛋白质组学研究非常需要的。目前，只有两种全新的蛋白质测序方法可用，即Edman降解和质谱(MS)，这两种方法都有几十年的历史。尽管并行化和自动化不断努力提高这两种方法的效率，但在检测限、动态范围、测序长度和精度等方面仍然存在很大的局限性，制约了这些技术的应用。与已经经历了几代技术革命的核酸测序相比，蛋白质测序的发展严重滞后。

在过去的几年里，新的蛋白质测序方法被提出和报道，如荧光测序、单分子肽指纹图谱、氨基酸隧道识别和基于纳米孔的蛋白质测序。在这些方法中，纳米孔技术由于其在DNA测序中的成功应用而具有巨大的潜力；然而，蛋白质由20种不同的氨基酸组成，而DNA只由4种不同的核苷酸组成。读出20个可识别的信号是一个巨大的挑战。此外，与具有均匀负电荷的DNA分子不同，肽链在通过纳米孔转运时是不均匀带电的，难以控制。然而，许多尝试捕获和读取蛋白质或肽链的纳米孔已被报道。

早期的研究主要集中在通过纳米孔观察短肽的直接易位。为了解决蛋白质在纳米孔易位之前展开的问题，有几种策略被报道，包括添加变性剂、热展开、将DNA标签附着到蛋白质亚策略和使用展开酶介导蛋白质易位。最近，人们开始研究不同大小、长度和电荷、翻译后修饰甚至单个氨基酸差异的肽的区分方法可以揭示序列信息。值得注意的是，在2021年，三个小组独立地使用DNA马达通过纳米孔棘轮刺入DNA-肽偶联物，在此过程中读取肽序列。虽然由于控制运动可以识别单个氨基酸变体，但无法破译氨基酸序列信息。

实验装置图（图源自Nature Methods ）

该研究提出了一种基于酶裂解和主客相互作用辅助的纳米孔传感相结合的肽测序替代策略。短肽通过α-溶血素(αHL)纳米孔的易位几乎不会产生任何可识别的电流事件。值得注意的是，研究发现，当含有N端苯丙氨酸(F)的肽与胍环(CB[7])形成主客体复合物时，胍环(CB[7])通过αHL的转位会产生规则的、延长的电流事件。该研究设计了一系列模型肽FG1-3XD6-10，其中X表示20种蛋白质原氨基酸中的任意一种。

聚天冬氨酸链上的负电荷为电场作用下的易位提供了动力，也提高了捕获率。FG和CB[7]之间的强相互作用可以将CB[7]复合物保持在αHL的收缩周围，并在CB[7]解绑之前有足够的时间对电流变化进行敏感测量。每个电流阻断对应于肽的捕获(CB[7])和CB[7]的解结合，随后肽从顺式侧转到反式侧，其特征为平均剩余电流I和阻断持续时间tD。该平台的未来发展将克服当前测序程序的局限性，为蛋白质组学研究提供一种新的蛋白质测序技术。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-02095-4

转自：“iNature”微信公众号

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