鞘鞘醇-1-磷酸(S1P)是真核生物中重要的鞘脂代谢产物之一，在免疫系统和血管系统中起着生物活性脂质介质的作用。S1P通过两种机制促进其生理作用，结合细胞内靶点或细胞外分泌。

2023年12月20日，复旦大学任若冰、陈立及戴薇共同通讯在Cell Research在线发表题为“Molecular basis of Spns2-facilitated sphingosine-1-phosphate transport”的研究论文，该研究揭示了Spns2促进鞘氨醇-1-磷酸运输的分子基础。

该研究报道了人类Spns2与S1P或抑制剂16d结合的两个内向开放构象的冷冻电镜(EM)结构。该研究还建立了基于细胞的S1P外排实验和评估斑马鱼心脏发育的体内实验。Spns2缺失导致斑马鱼出现双心脏表型。结合结构信息和功能分析，研究人员进行了广泛的诱变研究，以破译参与S1P识别的关键残基，并通过S1P运输改变Spns2的构象。该研究对深入了解S1P的转运机制，指导合理的药物设计具有重要意义。

Spinster同源物在真核生物中高度保守。人类Spns2是一个经典的MFS成员，具有12个跨膜螺旋，分子量约为58 kDa，对于冷冻电镜分析来说很小。因此，研究人员在Spns2胞内环2的F222和T223之间融合了一个PGS (Pyrococcus abyssi glycogen synthase)蛋白(UniProt ID: Q9V2J8)(命名为Spns2fusion)，以扩大蛋白的大小，以便于冷冻电镜结构测定。值得注意的是，Spns2融合主要在质膜中表达，并保持了与野生型(WT) Spns2相似的S1P转运活性。此外，经过亲和纯化和层析纯化后，Spns2fusion在溶液中呈现单分散行为。使用冷冻电镜以3.60 ?的总分辨率确定了Spns2融合构建体的结构。

值得注意的是，中心腔内拉长的额外密度延伸到C端结构域(CTD)。这个密度可以很好地容纳一个S1P分子。亲和选择质谱分析结果证实内源性S1P与Spns2结合。Spns2为内向开放构象，由N端结构域(NTD，包括TM1-6)和CTD(包括TM7-12)组成。这两个结构域由一个长而灵活的细胞质环和一个短的细胞内螺旋连接。在Spns2的NTD和CTD之间观察到一个大的细胞内两亲性空腔。

S1P的磷酸化基与Spns2形成广泛的极性相互作用，特别是TM11上的Q463和S464残基，S1P的氨基与TM7上的S326相互作用。S1P的烷基尾部插入到主要由TM7-10上的疏水残基组成的口袋中，并且TM1-2和TM5上的几个残基围绕在S1P的NTD侧。鉴于上述结构分析，作者通过S1P转运实验制作突变体来验证这些残基的重要性。与WT Spns2相比，S326、Q463和S464的双突变体和三突变体以及Y246和I429的丙氨酸取代显著降低了S1P转运活性，但其他残基的影响较小。此外，还在Spns2基因敲除的斑马鱼中进行了挽救实验，以追踪胚胎心脏发育。与S1P外排实验结果一致，Y246、I429的丙氨酸替换以及S326、Q463和S464的三重突变体也显著影响了斑马鱼的心脏发育。

Spns2介导的S1P转运周期示意图（图源自Cell Research ）

该研究报道了人类Spns2的两个内向开放结构，分别与S1P和抑制剂16d结合。通过细胞外排实验和斑马鱼体内胚胎心脏发育实验，验证了结构中的S1P结合位点，并确定了S1P通过Spns2转运的关键残基。带正电的残基R227和R119对S1P的转运至关重要，可能作为“holder”，促进S1P的磷酸化基团从细胞内侧翻转到细胞外侧。疾病相关残基R200可能在稳定NTD构象中起着至关重要的作用，R200的丝氨酸取代导致Spns2异常易位到质膜。这些带电残基之间广泛而动态的氢键网络也可能在S1P输运循环中稳定特定的构象。该研究提出了一个由Spns2促进的S1P传输的交替访问周期。此外，还提出了使用类似于S1P的机制通过Spns2传输FTY720-P。总之，该研究揭示了Spns2转运S1P的机制，将促进Spns2抑制剂新化学支架的优化或探索。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00908-x

转自：“iNature”微信公众号

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