虽然DNA N6-甲基脱氧腺苷(6mA)在细菌和原生生物中含量丰富，但其在哺乳动物基因组中的存在和功能尚不清楚。

2024年1月11日，芝加哥大学何川团队在Molecular Cell 在线发表题为“Sequencing of N6-methyl-deoxyadenosine at single-base resolution across the mammalian genome”的研究论文，该研究提出了一种不依赖抗体直接读取6mA测序(DR-6mA-seq)的方法，以碱基分辨率测量6mA。DR-6mA-seq采用一种独特的基于突变的策略来揭示6mA位点作为错误结合的特征，而不需要任何化学或酶对6mA进行调节。

通过在大肠杆菌DNA中成功定位表征良好的G(6mA)TC基序来验证DR-6mA-seq。正如预期的那样，当将DR-6mA-seq应用于哺乳动物系统时，发现基因组DNA (gDNA) 6mA丰度在大多数哺乳动物组织和细胞中普遍较低；然而，研究人员确实在小鼠睾丸和胶质母细胞瘤细胞中观察到不同的gDNA 6mA位点。总之，DR-6mA-seq提供了一种以单碱基分辨率检测6mA的工具，可以全面了解真核生物中的DNA 6mA。

另外，2024年1月10日，芝加哥大学何川团队在Nature Methods 在线发表题为“Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing”的研究论文，该研究提出了一种基于逆转录的RBP结合位点测序(ARTR-seq)的检测方法，该方法依赖于抗体引导下RBP结合RNA的原位逆转录来识别RBP结合位点。ARTR-seq避免了紫外线交联和免疫沉淀，允许从少至20个细胞或组织切片中高效和特异性地鉴定RBP结合位点。利用快速甲醛固定的优势，ARTR-seq能够在短时间内捕获RBP的动态RNA结合，正如在短至10分钟的时间范围内对应力颗粒组装过程中G3BP1的动态RNA结合的分析所证明的那样（点击阅读）。

2024年1月2日，芝加哥大学何川及戴庆共同通讯在Nature Biotechnology在线发表题为“Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA”的研究论文，该研究提出了超快BS-seq (UBS-seq)，它使用高浓度亚硫酸氢盐试剂和高反应温度将亚硫酸氢盐反应加速约13倍，从而减少DNA损伤和降低背景噪声。UBS-seq允许从少量纯化的基因组DNA构建文库，例如来自无细胞DNA或直接来自1至100个小鼠胚胎干细胞，与传统的BS-seq相比，对5mC水平的高估较少，基因组覆盖率更高。此外，UBS-seq从低输入的mRNA定量绘制RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)，并允许在高度结构化的RNA序列中检测m5C化学计量学。UBS-seq结果确定了NSUN2是主要的“书写”蛋白，负责HeLa mRNA中约90%的m5C位点的沉积，并揭示了哺乳动物mRNA 5 ' -区域中富集的m5C位点，这可能在mRNA翻译调节中具有功能作用（点击阅读）。

共价DNA修饰是多种生物系统中重要的表观遗传标记其中，6mA是细菌和原生生物基因组中普遍存在的一种修饰，在限制性修饰系统、DNA修复、复制、转录、类核分离和基因表达调控等方面发挥着关键作用。尽管6mA在原核生物和低级真核生物中都有很好的特征，但在高级真核生物，尤其是哺乳动物的基因组中，6mA被认为是一种罕见的DNA修饰。

由于6mA在大多数哺乳动物基因组中的修饰水平相当低，因此需要灵敏而准确的测序方法来检测6mA的存在。超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS/MS)已广泛用于定量全球6mA水平，但读数极易受到细胞培养感染、质粒和试剂引起的细菌DNA污染物的影响。同时，哺乳动物DNA样品中的6mA浓度通常在UHPLC-MS/MS的检出限附近，进一步加剧了细菌DNA污染的影响。这些因素突出了开发高灵敏度、碱基分辨率和全基因组定位方法用于6mA测序的关键需求。

DNA免疫沉淀测序(DIP-seq)，有时与外切酶酶切(6mA交联外切酶测序；6mACE-seq或ChIP-exo)已被广泛用于生成6mA的全基因组图谱。尽管它能够表征哺乳动物gDNA中的6mA，但人们担心抗体脱靶结合、阅读错位和RNA污染可能导致使用这些基于抗体的方法检测6mA的人为假阳性基于限制性酶切的方法，如6mA-RE-seq和DpnI-seq，产生单核苷酸分辨率修饰谱，但仅限于检测特定的序列基序。

机理模式图（图源自Molecular Cell ）

最近的一项研究报道了一种碱基分辨率6mA测序方法，该方法依赖于亚硝酸盐介导的未修饰A位点的脱胺虽然该策略是新颖的，但该方法仍需要相当大的改进，以提高脱氨率，以避免假阴性或假阳性位点。除了下一代基于测序的技术之外，第三代单分子实时(SMRT)测序已经实现，它可以直接识别DNA甲基化细菌基因组的高置信度6mA检测。然而，在对哺乳动物DNA进行SMRT时，观察到很高的错误发现率(FDRs)，可能是由于许多因素，包括非常低水平的6mA加上高水平的5mC，缺乏一致的6mA序列背景，以及含有6mA的细菌污染物的存在。

该研究报道了DR-6mA-seq的开发和应用，该技术能够对全基因组中的6mA进行高置信度、基于突变、碱基分辨率的检测。研究结果揭示了6mA在不同类型哺乳动物gDNAs中的基因组模式。与之前的报告一致，们观察到大多数哺乳动物DNA中的6mA水平非常低;然而，确实在特定细胞类型中检测到显著甲基化的gDNA 6mA位点。总之，DR-6mA-seq提供了一种以单碱基分辨率检测6mA的工具，可以全面了解真核生物中的DNA 6mA。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.12.021

转自：“iNature”微信公众号

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