为了缩小选择范围，实验中通常要考虑以下几个方面：

1. 分析或者应用类型

2. 样品的性质

3. 样品的物种

4. 一抗的宿主物种

5. 抗体的标记和检测

1

应用

识别相同蛋白的不同抗体，由于识别位点不同，决定了不同的使用用途。例如，许多抗体识别位点位于折叠蛋白的内部，因此抗体只能识别降解或变性蛋白，这样的抗体往往只能应用于western blotting。有的抗体能够识别自然折叠状态上的表位。这样的抗体可应用于IHC、IF、FACS等应用。

当搜寻用于免疫组化的抗体时，则应注意有些抗体不能结合福尔马林固定和石蜡包埋组织中的目标抗原，只适合用于未固定的冰冻组织。

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样品的性质

刺激宿主动物产生抗体的抗原物质种类繁多，包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体（例如细菌）或细胞。免疫原通常在说明书中会有显示（但有一些情况抗原是专利资料，不能公开）。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域，应该选择由该特异片段或区域或者包含该特异片段或区域所制备的抗体。如果要通过 FACS 去检测活细胞表面蛋白，则要选择由胞外区蛋白抗原制备的抗体。

3

样品的物种

选择抗体的时候，首选和待检测样本同一物种抗原制备的抗体。由于不同物种之间氨基酸序列的同源性，抗体有可能和其它物种的同一靶蛋白反应。说明书上没有提到的物种，并不代表抗体不可以用来检测这种样品，但是由于来自该物种的样品未被检测过，因此很难推荐它的适用性。

若实在找不到待检测物种的抗体，可以根据物种之间序列相似性预测交叉反应性。

4

一抗的宿主物种

一般来说，当用标记二抗来检测非标记一抗时，产生一抗的宿主动物的类别就非常重要。对于免疫组化，产生一抗的宿主应尽可能和样品的宿主种类不同，以避免二抗与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。

例如，用于检测鼠源蛋白的一抗就不应来源于小鼠或大鼠，选用来源于兔的一抗和抗兔的二抗进行检测，会比较合适。如一抗已直接附有标记，则可避免上述交叉反应发生。对于不含内源性免疫球蛋白样品的检测，宿主的种类选择不用很严格。例如进行 western blotting 的细胞裂解液就被认为不包含 IgG。而组织裂解液和组织培养上清（包括血清）则被认为是含免疫球蛋白的。Western blotting 时样品中IgG 会以 50 和 25 kDa 的条带出现在降解和变性样品中，分别是 IgG 分子的重链和轻链。

5

抗体的标记和检测

双重染色抗体的选择

对培养细胞或组织进行双免疫染色要求非标记一抗来源于不同物种的动物，而二抗则特异性识别其中一种一抗。二抗如果与其他动物来源的免疫球蛋白有交叉吸附，则会在说明书中明确说明。

标记抗体的选择

在抗体上添加标记的目的是为了可以直观的看到被检测抗原的情况。抗体标记的选择依据以下几个方面：

1）检测方法：荧光或有色沉淀。标记的荧光会在特定波长的光激发下发光。有多种的荧光可供选用，不同荧光标签有独特的吸收和激发波长。而酶标记的抗体在使用合适的底物时，可以形成有色沉淀。

2）封固剂（只限免疫组化）：AEC、Fast Red、INT 或是其它的水溶性染色剂均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固剂。荧光素标签需要水溶性封固剂。胆藻素蛋白（藻青蛋白/藻红蛋白）需要不加甘油的水溶性封固剂，否则会产生淬灭效应。

3） 生物素标记的抗体对于信号的放大是很有效的，比如可应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物（通常缩写为 ABC 试剂）或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法。

转自：“Super Lab”微信公众号

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