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  • RNA质量好不好决定下一步实验成败

    阅读: 2024/2/1 14:54:48

    导读

    合格的RNA样本是进行很多实验的前提,RNA质检有很多种方法,相对来说,琼脂糖凝胶电泳是一种非常好的RNA质检方法,既能检测RNA的完整性和浓度,还能判断RNA样本中是否有蛋白和gDNA的污染情况,而且不需要依赖特殊昂贵的仪器设备。但是RNA电泳虽然简单,也有很多注意事项,如果稍有不慎,电泳过程中RNA样本发生降解,即使合格的样本也会显示出不好的质检结果。

    RNA电泳 VS 其它检测方法

    常用的RNA质检方法有紫外分光光度计法(Nanodrop)、Qubit法以及琼脂糖凝胶电泳等方法。其中:紫外分光光度计法(Nanodrop)是根据样本的A260和A280吸光度来判断RNA的浓度和纯度,但Nanodrop无法判断RNA的完整性,且Nanodrop无法区分DNA以及降解的RNA,因此Nanodrop检测结果可能并不准,经常发生虚高。Qubit是利用RNA结合的荧光染料来检测RNA的浓度,Qubit试剂能够区分RNA和DNA,准确性和特异性要好于Nanodrop,但是仍然存在着无法检测RNA完整性的问题。而RNA电泳则通过分析三条rRNA的条带,判断RNA的降解程度、浓度以及DNA和蛋白的污染情况。琼脂糖凝胶电泳不需要使用特殊的仪器,实验门槛更低,结果也更加多维可靠。

    变性胶 VS 非变性胶

    RNA电泳有变性胶电泳和非变性胶电泳两种方式。其中变性胶电泳是指在配制凝胶时加入甲醛等变性剂,能够打开RNA的二级结构,减少RNA二聚体的含量,能够精准的检测RNA的分子量。但是变性胶操作复杂,需要使用到甲醛等有害物质,因此,只有在Northern等实验中才会用到变性胶电泳。常规的RNA质检,用非变性胶电泳即可,非变性胶电泳和普通的琼脂糖凝胶电泳一样,用TAE或者TBE配制的凝胶,能够满足RNA基本的质检分析。

    RNA电泳的注意事项及材料准备

    RNA的电泳的步骤和所需材料,和普通DNA电泳所需的是一致的,只不过为了保证RNA在电泳过程中不被降解,所用到的器具和试剂需要用RNase-free 的。如实验要用到的电泳缓冲液(TAE或者TBE)、核酸染料、琼脂糖凝胶等试剂,一定要现配现用,且都需要用RNase free的H2O来配制(如DEPC处理过的ddH2O)。另外,电泳所需要用到的电泳槽、制胶槽、梳子也需要确保没有RNase污染,可以先用自来水冲洗干净,再用RNase free H20冲洗一次,然后用100%乙醇擦拭一次晾干备用。

    RNA电泳结果判读

    核糖体RNA(rRNA)是细胞中丰度最高的RNA类型,也是RNA电泳主要检测的对象。rRNA有三种类型,以真核生物为例,分别28S,18S和5S,这三种类型的rRNA分别对应了电泳结果中的三条条带。完整的RNA样本中的这三条带应该是明亮的、清晰的、无拖尾的,并且28s RNA的条带一般会比18s RNA亮(个别物种可能有例外),否则说明RNA样本已经发生了降解。另外,除了看三条rRNA条带之外,还需要看有没有gDNA(一般在28S rRNA上方)和蛋白(一般在胶孔处)的条带,如果RNA样本中有蛋白和gDNA的污染,有可能也会影响到下游的实验结果。以下是一些典型的电泳结果。

    图A:提取的RNA完整性较好

    图B:可以明显看到28s的条带明显弱于18s条带,RNA已经发生大量降解

    图C:28s RNA条带上方和电泳孔处有条带,说明有蛋白和gDNA污染

    转自:“Super Lab”微信公众号

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