实验结果为何不尽人意，追本溯源后样本制备/处理是杀手！我们都知道流式样本制备作为流式细胞术至关重要的一环，对实验的成败有着举足轻重的作用。

下面小编将流式细胞术中常见的样本制备方法给大家做一个小小的总结。让你完美制备实验样本，实验也能快人一步！！！

图1.流式实验流程示意图

样本制备

流式细胞术检测的样本为单细胞悬液，因此，悬浮细胞或外周血细胞在流式分析时简便、快捷。对于贴壁细胞及实体组织在进行流式染色前，需要制成单细胞悬液，常用方法包括酶消化或机械性的组织解离。

流式细胞术常见的样本有以下几种：

每种样本均具有各自的特性，小编也为大家整理了常见样本处理方法，如下：

一

培养细胞单细胞悬液制备

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悬浮细胞

用移液枪吹打混匀；

收集于15 mL或50 mL离心管中（根据细胞量选用）；

离心洗涤后重悬获得单细胞悬液，调整细胞浓度至1×/107mL。

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贴壁细胞

倒掉培养基，用10 mL 1×PBS，pH 7.4清洗后，再用3 mL 0.05% Trypsin-EDTA 溶液室温下消化3 min，显微镜下观察有大量细胞脱落；

用15 mL培养基终止反应，接着用移液枪反复吹打冲洗贴壁细胞，收集于15 mL或50 mL离心管中（根据细胞量选用）。

离心洗涤后重悬获得单细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/mL。

图2.流式检测细胞

二

外周血单细胞悬液制备

血细胞成分包括红细胞、白细胞和血小板等。白细胞包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。对某一群细胞检测分析时，可对血液样本进行处理获得单一细胞群体。

图3.血液细胞类型（

源于网页）

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外周血单细胞悬液制备

采集人或鼠的外周血样本于抗凝管中（一般选择肝素或EDTA），室温保存，血液样品离体建议2 h内处理效果最佳，若无法及时处理，4℃保存，此时最好选择肝素抗凝管。

使用红细胞裂解液裂解红细胞，裂红建议时间5~15min。

离心洗涤去除红细胞碎片后重悬至单细胞悬液。

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外周血单个核细胞（PBMC）样本制备

外周血单个核细胞（PBMC，peripheral blood mononuclear cell）：其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分。

Ficoll提取PBMC流程：

将收集的血液置于室温15 min；打开超净工作台紫外消杀30 min；50 mL离心管若干备用，RPMI1640培养基和分离液备用。

在超净台中准备新的无菌50 mL离心管固定于试管架上，取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血 。

取50ml的离心管，首先向无菌离心管内加入适量的PBMC分离液（当稀释后血液体积小于3 mL时，加入3 mL分离液；大于等于3 mL，加入等体积分离液。但两者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果。），可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面，如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。

离心力 600 g~1200 g，室温离心 20 min~30 min，血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200 g。

吸取单核细胞层：离心结束后，吸弃血浆层，小心吸取PBMC层（即白膜层）并转移至15 mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为血浆层、PBMC层、分离液层和红细胞层。（一般15 mL血液可吸取3-5 mL的PBMC层）。

图4.外周血离心前后的分层态图

用1640培养基适当悬洗细胞，离心力500-700 g，离心10 min；

去除上清，1640培养基重悬细胞，离心力400 g，离心5 min；

去除上清，混悬细胞，若沉淀中有较多红细胞，可在沉淀中加入1 mL 红细胞（RBC）裂解液用移液枪吹匀，室温下反应1 min；后（红细胞裂解液：无菌PBS体积比=1:9）加入9 mL无菌PBS吹匀悬液；将悬液用200目75 μm过滤网进行过滤至新的15 mL离心管内；另取20 μL细胞悬液，依照细胞计数标准操作流程进行细胞计数。

图5.流式检测人PBMC样本-TBNK细胞分型

三

实体组织单细胞悬液制备

不同实体组织成分特点不同，制备方法不同。处理不同组织时，采用对细胞损伤小、产率高的单细胞悬液制备方法，最大限度保持细胞原有特性。

样本处理方法：

1、酶消化法：

不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异性消化作用，可根据不同组织类型确定使用酶的种类。

常用酶类试剂有：胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶。

适用样本类型有：肝脏、肾脏、心脏、肺、脊髓、脑、肠道、皮肤等。

2、机械法：

机械法分散实体组织包括：剪碎法、研磨法、网搓法等。

适用样本类型：脾脏、淋巴结、胸腺等。

机械法容易造成细胞碎片和细胞团块，常与其他方法配合使用。若组织为脾脏，研磨法处理后需要裂解红细胞，离心洗涤去除红细胞碎片后重悬至单细胞悬液。

样本制备流程：

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脾脏组织

取出脾脏并置于装有20 mL含1×P/S的RPMI 1640培养基的10 cm平皿中；

将脾脏置于75 μm细胞过滤筛中，使用研磨棒将过滤筛中的脾脏研磨成单一的细胞（注意：边研磨边移动细胞过滤筛，并使用培养基冲洗细胞过滤筛，以便于细胞分散于培养基中）；

将含有细胞的培养基移入50 mL离心管中，并使用新的培养基冲洗平皿，同样将培养基移入离心管中，培养基总量不超过30 mL；

裂红处理：室温离心1500 rpm x 5 min，去上清，留细胞，加入13 mL常温的红细胞裂解液进行红细胞裂解，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1 min，加入基础培养基37 mL，混匀，终止红细胞裂解；

离心，1500 rpm，5 min，弃去上清；

加入20 mL培养基，重悬细胞，并利用细胞过滤筛过滤细胞悬液；

离心，1500 rpm，5 min，弃去上清；

加入20 mL完全培养基（RPMI 1640 + 10% FBS + 1 × P/S）重悬细胞，准备细胞计数。

图6.流式检测小鼠脾脏样本-T细胞分型

02

胸腺组织

取出胸腺并浸泡于装有10 mL含1%双抗溶液的无血清培养基10 cm培养皿中；

将胸腺置于200目筛网中，用组织研磨棒轻轻研磨至没有明显块状物；

用15 mL PBS冲洗筛网，并将冲洗液收集于15 mL离心管，300 g离心5 min，弃上清；

用完全培养基重悬胸腺细胞，用200目筛网过滤悬液，300 g离心5 min，弃上清，用完全培养基重悬胸腺细胞并调整细胞浓度至1×107/mL。

图7.流式检测小鼠胸腺样本

样本处理

有效的样本处理方式及条件的选择是实验成功的基础，以确保样本中靶标的表达。如免疫细胞通常需要刺激活化后才能快速增殖或分化为成熟细胞，活化状态的细胞常高表达特定的转录因子、细胞因子等，这些靶标可通过流式细胞术进行检测。

实验开始前，建议根据具体的细胞类型、靶标的表达水平及实验条件进行合理的实验设计及样本处理，这样才能实验事半功倍。

下面的注意事项或许你踩过坑，或许你忽略过，今天让小编为大家扫扫实验样本处理的绊脚石！

图8.常见样本处理的几种方式

案例一：HUVEC内皮细胞中CD62E表达情况检测

正常内皮细胞不表达CD62E，但当内皮细胞受到炎症因子如TNF-α的刺激时，CD62E的表达会增加。

案例二：采用嘌呤霉素（Puromycin）掺入检测C6细胞蛋白合成水平

Puromycin是一种蛋白质合成抑制剂，可以掺入蛋白质翻译过程，并导致蛋白质翻译终止，带有嘌呤霉素的多肽会从核糖体中释放出来。

采用嘌呤霉素的抗体，结合免疫印迹（WB）、免疫荧光（IF）和流式（FC）等方法，可以对蛋白质合成进行检测和分析。

转自：“Super Lab”微信公众号

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