免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，包括荧光抗体法和荧光抗原法，但在实际工作中荧光抗原技术应用较少。

细胞免疫荧光染色是免疫荧光技术在细胞中的应用。

01 技术特点

优点：特异性强、敏感性高、速度快。

缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

02 免疫荧光染色原理

主要原理：利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。

主要包括蛋白和一抗结合；其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。

03 简单的细胞免疫荧光实验步骤

1.漂洗血清蛋白pH7.2-7.4，37℃，PBS，2h；

2.零下20℃甲醇固定20min后，自然干燥10min；

3.PBS洗净:3min，3次；

4.1%Triton:25min-30min，配成50ul triton+5ml PBS；

5.PBS洗净:2次，5min；

6.羊血清封闭：37℃，20min；

7.一抗，4℃过夜，一般要＞18h或37℃，1-2h；

8.4℃，PBS洗净，3min，5次；

9.二抗，37℃，＜1h；

10.37℃，PBS洗净，3次，5min；

11.晾干封片(封闭液pH8.5)。

注意：

不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。

04 zo-1的免疫荧光染色实验步骤

1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出；

2.用预温的1×PBS洗三次，每次10min；

3.4%的甲醛室温固定20-30min；

4.1×PBS洗3次，每次10min；　

5.0.2%Triton X-100透化2-5min；

6.1×PBS洗3次，每次10min；

7.5%BSA室温封闭30min；

8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4℃过夜

9.1×PBS洗3次，每次10min；

10.加二抗(用1%BSA稀释)30min，闭光；

11.1×PBS洗3次，每次10min；

12.95%甘油封片。

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释。

05 细胞爬片的免疫荧光实验步骤

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍；

注意：

a.有时候细胞爬片可能较小，因此夹取时要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免来回夹取；

b.洗的时候加PBS不要太冲，不要把细胞冲下来，可以尝试一下洗的时候多加PBS，稍晃一下就倒掉，不等5min或10min。

2.4%冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗三遍；

3.0.2%Triton X-100通透10min，PBS洗三遍；

4.与二抗相同宿主的血清封闭30min，PBS洗三遍；

5.一抗4℃湿盒内过夜或37℃，2h（前者效果可能好一些），PBS洗三遍；

6.二抗室温2h(避光)，或者37℃，1.5h，PBS洗三遍；

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片；

8.蒸馏水洗掉PBS，用甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不像树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

建议：

a.染完之后没有封片之前直接照一部分，因为有的时候可能封片会出问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭。

b.荧光的片子一定要避光保存，若保存得当，过一段时间仍然能照出很好的片子。

c.二抗用之前一定要离心，不然可能有沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

06 常见荧光染料

1.异硫氰酸（FITC）：绿色530nm；

2.藻红蛋白（PE）：橙黄色575nm；

3.多甲藻黄素叶绿素蛋白（PerCP）：深红色675nm；

4.碘化丙啶（PI）：橙红色620nm，488nm波长的氩离子激光激发；

5.别藻青蛋白（APC）：红色660nm，630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发；

6.Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm；

7.Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。

信号弱或无信号

靶标蛋白丰度低

查阅参考文献，核实待检细胞是否表达目的蛋白以及靶标蛋白的表达丰度

通过Western-blot验证靶标蛋白是否在样品中表达及表达丰度

建议使用间接免疫荧光检测，以放大信号

靶标蛋白在胞内

甲醇和丙酮固定可透化细胞

甲醛固定，需尝试不同百分比的 Triton X-100 (0.1-0.25%)或Tween-20透化细胞

适当延长通透时间

固定方法不当，破坏靶标蛋白的抗原表位

更换固定液，优化固定时间

抗体不适用ICC/IF

查看抗体说明书，抗体是否经ICC/IF实验验证

抗体浓度过低

增加一抗/二抗的工作浓度，或者通过梯度稀释确定抗体最佳稀释度

建议4℃过夜孵育

一抗与二抗不匹配

确保使用针对一抗物种产生的二抗

确保二抗针对的同种型与一抗同种型相匹配

荧光信号淬灭

避光条件下孵育荧光抗体

样品封片时加入抗淬灭试剂

建议封片后立即进行成像

荧光显微镜通道选择不合适

确保选择的荧光团激发/发射波长与检测通道相匹配

样品的储存时间过长

使用新鲜制备的样品，避免抗原被破坏

一抗不与靶标蛋白结合

使用经验证适用于检测靶标蛋白的一抗

设置阳性对照（例如，过表达靶标蛋白的细胞）检测抗体功能

“

免疫荧光中整个细胞片都出现荧光亮点（如图2），一般是由于样本、器皿、成像介质的自发荧光或荧光染料非特异性结合造成的高背景。这时我们可以从以下几点排查：

高背景

封闭不充分或封闭液不合适

适当延长封闭时间

更换封闭剂，推荐使用二抗宿主来源的血清进行封闭

抗体浓度过高

适当降低抗体浓度，或者通过梯度稀释确定抗体最佳稀释度

二抗非特异性吸附

设置不孵一抗、只孵二抗的阴性对照

建议使用预吸附二抗

洗涤不充分

在洗涤液中加入tween20，并适当增加洗涤时间和洗涤次数

自发荧光

设置未染色的样品为阴性对照，检测自发荧光

封闭液中添加终浓度为0.3mol/L甘氨酸或使用非醛类固定液

细胞自发荧光在蓝色波长中高，避免对低丰度靶标蛋白使用蓝色荧光抗体

旧甲醛溶液易产生自发荧光，更换新鲜配制的甲醛固定液

固定后，样本充分洗涤，去除固定液残留

更换自发荧光低的器皿

信号强度低，产生背景噪音

优化信噪比，使用更亮的荧光素进行检测

实验允许情况下，增加靶标蛋白表达量（过表达或诱导剂）

样本变干

在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥

一抗非特异性结合

使用经实验验证适用于细胞样品免疫荧光的一抗

使用与样本物种不同种属来源的抗体

设置敲除/敲低靶标蛋白的阴性对照

光谱重叠（多色实验）

调整显微镜设置，一次只接收一个荧光素信号

尽量选择没有光谱重叠的荧光素

转自：“Super Lab”微信公众号

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