质粒构建：英文名为plasmid construction。选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

如何选择载体？

载体通常分为克隆载体（Cloning Vector）与表达载体（Expression Vectors）两种。

克隆载体大多是高拷贝载体，能够将外源基因与克隆载体的质粒连接，导入原核细菌内，进行大量复制克隆。主要用途是保存目的基因片段。

1. 在选择克隆载体时应注意：

① 具有自主复制能力，拷贝数高；

②携带易于筛选的选择标记；

③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；

④载体应尽可能小（＜15kb），便于导入细胞和进行繁殖；

⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

表达载体是为了使插入的外源DNA序列转录、翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号。

2. 根据表达的类型，表达载体可分四类：

① 非融合型表达载体，如PKK223-3；

② 分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1；

③ 融合蛋白型表达载体，如PGEX；

④ 包涵体型表达载体，如pBV220。

引物设计注意事项

在构建质粒时，设计引物时应该考虑引物长度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物间出现配对突变或二次结构等情况。

前向引物：5’ 端 -- 上游克隆载体末端同源序列 + 基因正向扩增引物 --3’ 端

反向引物：3’ 端 -- 基因反向扩增引物 + 下游克隆载体末端同源序列 --5’ 端

运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计注意事项：

① 引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；

③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；

④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；

⑤引物的3' 端要避免出现连续重复的碱基，如 GGG 或 CCC ，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是 G 或 C；

⑥在引物的 5′ 端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。

PCR扩增中常见的问题

① 如结果出现引物二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象，可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，来提高扩增特异性。

② 若出现凝胶条带弥散状态，多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因。

③ 长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键。

酶切位点的选择

选择合适的剪切酶和连接酶对于质粒构建至关重要。剪切酶的选择应该考虑酶切位点的位置、酶的反应条件等因素。连接酶的选择应该根据所用的质粒载体和目的基因的大小来确定。

① 选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

② 一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

③ 实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

④ 尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

⑤ 两个酶切点至少隔上3个碱基。

⑥ 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

⑦ 最好使用酶切效率高的酶。

⑧ 最好使用双酶切有共同buffer的酶。

⑨ 在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足。

转自：“Super Lab”微信公众号

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