免疫组化简介

免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)技术，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。广泛的应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。

免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。

石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。

免疫组化是个苦活，耗费时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。想染出了漂亮的片子和实验结果就必须要有正确的实验思路和操作方法。

免疫组化的步骤详解

1、在60°烤箱烤片30~60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子最好是找专业培训郭的人员切片，片子的厚薄均匀，切片的完整，无褶无刀痕。

2、脱蜡水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自来水洗一下，但不要直接对着切片冲洗。

3、抗原修复，小编用的是高压热修复，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液，一定要全部浸泡切片，等高压锅冒气后5min结束，自然冷却，温度剧降可能引起脱片哦。3%H202避光浸泡15min。

4、用免疫组化油笔围绕组织画圈，接下来就能看见它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS会被锁在画的圈中，不会流干，保证不干片。

免疫组化结果分析

很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。如何正确地分析，得出理想的结果。

结果分析主要有两种方法：阳性着色细胞计数法和评分法。

前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；

后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

1.对照染色

没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

2.定位

抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.肉眼定量

因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个视野。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。

4.图像分析软件

如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析软件，图像分析软件类型很多。

Image J为例，一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了其界面非常简洁，如下图所示：

现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？

首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。

步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。

步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。

有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。

步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。

然后，就可以正式开始分析了。

步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。

如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。

最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。

实验所需试剂

货号 试剂名称-(GBCBIO)

T3088 10XPBS Buffer

G0528 4%多聚甲醛溶液|4% Paraformaldehyde Solution

G7224 0.1M柠檬酸抗原修复液|Citrate Antigen Retrieval Solution

G7224S

EDTA抗原修复液(50X)|EDTA Antigen Retrieval Solution

G3433

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

G3024

PVP抗荧光淬灭封片液|Polyvinylpyrrolidone Antifade Mounting Medium

G4923 苏木素伊红（HE）染色试剂盒|Hematoxylin and Eosin Staining Kit

本文来源于捷倍斯生物、知乎、百度百科

转自：“Super Lab”微信公众号

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