实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是分子实验中基本的基因表达定量技术。具体是指在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。无论你是初入实验的新手还是科研技术大佬都需要这个实验来进行转基因的检测、组织表达的定量或标记基因的表达等。

说来简单，通常我们都是配一板PCR体系直接静待结果，可以说是一个小实验。虽然原理知识涉及的非常之广泛，如荧光阈值、Ct值等等，但真正去做实验的时候会发现只需要机器、相关酶、PCR板和移液枪。因此，存在的问题就是酶的选择、体系的配置、“三线合一”等等。针对这个问题，本文主要介绍一些关于这方面的实验技巧，大家自行查缺补漏呀！

qRT-PCR的引物设计

我们都知道，qRT-PCR有着自己的引物标准，通用的是打开PrimerBank：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/，相信这个操作大家并不陌生了。（友情提示：跨内含子可以用primer 5设计引物呀）简单进行总结，引物设计需要专用软件，内参基因与目的基因在内的所有引物的Tm不可以超过两度。特别的，引物设计的好坏直接影响扩增效率的高低，产物的特异性与否，所以正确设计引物是qPCR成功的第一步。在满足常规设计原则的基础上还需要满足以下几点：

1）目的片段的长度应该控制在100~300 bp；

2）对于突变体的基因表达量鉴定应该避免DNA的污染，引物最好设在两个外显子之间，横跨中间的内含子；

3）一定要检测扩增效率，达标后才可以用于定量实验；

4）用于标记基因检测物的引物序列最好源于已发表文献；

5）引物的浓度通常在0.1uM-1.0uM之间进行选择优化；

6）引物用完之后需要放入-20℃保存。尽量避免反复冻融影响扩增效果。

qRT-PCR的模版选择

对于突变体的鉴定，只需要cRNA反转录成功即可，因此模板选择可适当放宽。但是对于标记基因的鉴定并实现“三线合一”，那就需要进行严格的RNA定量，需要取等量的、未降解的RNA进行反转录并选择含有DNAase的试剂盒。反转好的cDNA模版需要进行稀释且不可长期保存，最好在一星期之内完成。

qRT-PCR中酶的选择

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酶的选择是保证结果质量的前体。目前我们所用的酶基本为市售，应该首选稳定、扩增效率高的酶。需要注意不能选择解冻后MIX粘性过大的，可能会导致加样时枪头出现挂液影响实验。

qRT-PCR中体系的配置

最基本的，需要三个平行体系。体系优先选择20 ul和50 ul，当然为了节约也是可以选择10 ul的。需要注意以下问题：

1）每次实验都需要用新的ddH2O；

2）体系配置采用先预混原则，混匀离心后保证无气泡；

3）确定反应数量，在此基础上增加5-10%并计算体积配置数量；

4）若模板为cDNA最好稀释5-10倍，减少发转录体系对qPCR实验的抑制作用；

5）若需要检测RNA模板是否有残留gDNA，可以将每个样本都配置NRT进行检测。

6）尽量用排枪操作，用同一枪头完成分装样品，最好都使用进口-.-！

转自：科研人直通车

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