PART 01

前言

聚对苯二甲酸乙二醇酯（ＰＥＴ）使用泛滥，但非常难降解，导致其污染物在生物圈中广泛分布，从而引发一系列生态和社会问题。目前己发现细菌Ideonella sakaiensis 201－F6可以产生IｓＰＥＴａｓｅ降解ＰＥＴ，但是其稳定性和活性较低导致降解效果并不理想，尤其是对于高结晶度的ＰＥＴ，降解效果微乎其微。

本研究是以IｓＰＥＴａｓｅ为研究材料，通过建立一套以进化算法、ｐ－ＮＰＰ显色反应初筛以及ＰＥＴ塑料降解效果评估相结合的ＰＥＴ降解酶蛋白工程化方法，构建ＰＥＴ降解效率更高的突变体，目的是得到稳定性和催化活性都提高的IｓＰＥＴａｓｅ突变体。

PART 02

实验方法

利用IｓＰＥＴａｓｅ蛋白序列在数据库ＮＣＢＩ中进行蛋白ｂｌａｓｔ。而后尝试不同的筛选条件进行设计。一种是为了使突变氨基酸避开蛋白质的重要功能位置。先设定Ｅｎｔｒｏｐｙ值大于０．７，避开过于保守的位置。再在此范围内选择一致性氨基酸的出现频率与野生型氨基酸的出现频率差异较大的氨基酸进行蛋白设计。另一种是只考虑氨基酸的一致性。如果一致性氨基酸的出现频率大于野生型氨基酸的出现频率６５％〇则选择相应的氨基酸进行突变（图２－１）。经实验验证成功的设计方法被设计成在线突变体设计工具Ｐｒｅｍｕｓｅ。

IsPETase突变体的ＰＥＴ降解功能验证

本部分实验通过将所得到的突变体进行组合。以得到稳定性提升效果最优的突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ。并测定其最适温度、最适ｐＨ、动力学常数来表征其催化特性的改变。之后，还将对突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ的无定型ＰＥＴ和高结晶度的ＰＥＴ降解效果进行验证。从而说明稳定性的提升最终导致其ＰＥＴ降解效果的提升。

组合突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ对无定型ＰＥＴ塑料的降解效果测定

通过ｐ－ＮＰＰ显色反应的表征方法，组合突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ的稳定性和催化速率均有一定程度的提高，为了证明这些改善的酶学性质可以提高突变体的ＰＥＴ降解效果。我们首先对组合突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ的无定型ＰＥＴ降解作用进行表征。将ＰＥＴ塑料片溶于六氟异丙醇，使ＰＥＴ的结晶度大幅下降，从而更容易被ISＰＥＴａｓｅ降解。

通过对无定型ＰＥＴ塑料降解反应体系进行ＨＰＬＣ分析，利用降解产物的产量来表征对无定型ＰＥＴ塑料降解效果。

可以发现，无定型ＰＥＴ塑料经过组合突变体Ｗ１５９Ｈ／Ｆ２２９Ｙ处理后，产生了明显的三个产物峰，且对相关产物峰进行积分，发现降解产物的总量是野生型的４０倍左右（图４－４Ａ、Ｂ）。而利用高分辨质谱液质联用手段对ＰＥＴ塑料降解产物进行鉴定，可以分别鉴定到实际荷质比［Ｍ－Ｈ］-为１６５．０１９８的降解产物，对应产物ＴＰＡ（计算分子量１６５．０１９３）；实际荷质比［Ｍ－Ｈ］-为２０９．０４６０的降解产物，对应产物ＭＨＥＴ（计算分子量２０９．０４５５）；实际荷质比［Ｍ－Ｈ］-为２５３．０７３０的降解产物，对应产物ＢＨＥＴ（计算分子量２５３．０７１８）。这与前人报道的特征产物是一致的，能够证明突变体确实对ＰＥＴ塑料又良好的降解作用（图４－５）。本部分实验为下文中组合突变体在ＰＥＴ塑料降解应用提供了实验基础。

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