问题：国自然预实验应该占比多少才算合适？

(1)如果按照研究方案的总体设计的完成比例来讲，预实验占到30-40%之间为宜。

国自然的申请是“要钱”的艺术，要向评审专家表达这个意思：“这个项目只能我来做，而且我能做好，但是我缺钱”。

这两种极端的预实验完成度，都不大合适：

①　实验空空：只有生信结果，一点细胞或者动物实验都没做；

②　实验比例过大：例如研究方案里说未来要用3株细胞系，预实验全做了；分子A的过表达、沉默都做了；动物实验也做了很多；分子互作中的荧光素酶实验、ChIP等分子实验丰富。这种情况专家也许会觉得没必要再资助了，因为剩下要做的实验就不太多了。

因此大概完成度在30-40%之间比较合适，太少则不足以支持科学假说，太多则完成度过高。

(2)如果按照预实验数据，能够支撑国自然的科学假说的角度出发，大概有以下一些实验是有必要的（A→B→C→通路X→表型Y→疾病Z）。

绿色部分代表“未完成”，而未来要完成的。

①　临床激活水平：研究材料为临床来源的组织样本，最常见的检测手段无非是通过表达水平来判断A、B、C分子的激活水平，mRNA常见的手段有：RNA-seq、qPCR、northernblot、FISH；蛋白水平常见检测手段有：ELISA、western blot、IHC、免疫荧光等；

②　相关性表达分析：根据RNA-seq或者qPCR的结果分析基因之间的相关系数；

③　细胞功能实验：可以分为小分子干预方式，或者对分子A、B、C或者通路X，进行过表达（overexpression）或者沉默（RNAi），甚至敲除（KO）干预，进行观察细胞的表型变化。也就是说，分为上调激活（gain of function）以及下调沉默（loss of function）的调控逻辑，检测细胞的表型改变（增殖，死亡，转移侵袭等）；

④　动物在体实验：模拟疾病发生的在体环境，观察分子A、B、C或者通路X的干预，对于疾病进展的影响，评估分子A、B、C或者通路X作为疾病治疗靶点的效果；

⑤　上下游作用关系的验证：A→B→C→通路X，需要通过挽救实验（rescue）来证明上下游关系，以证明调控轴（axis）的唯一性；

⑥　分子互作：指的就是下面这张图啦，各种IP、pulldown实验

⑦　结构预测：RNA具有序列特异性，蛋白质具有高级的空间结构，这些是它们之间互作的条件，为了揭示他们之间的互作特点，有必要深入探索RNA-DNA、蛋白-RNA、蛋白-蛋白、RNA-RNA之间互作的具体作用序列或者高级空间结构，可以通过分子对接分析来予以揭示。

所以，最后能完成30-40%研究方案中的内容，以支持国自然科学假说即可的预实验工作量较为合适。

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