方法一：

https://sg.idtdna.com/pages

1. Realtime PCR Tool

2. Refseq lookup

3.search

3. 如果有多个，前面的方框都选上，Design Assays。

4. 如下图设置好后，点击页面最下面的design assay

方法2：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

1. cDNA序列的获取

选择gene，输入基因的名称，如下图，然后点击Search 按钮。

2. 在搜到的结果中，选择种属的基因，单击基因名称，进入该基因的页面。

3. 找到该基因的对应的转录本的ID，以NM开头，单击。有了转录本的就可以进行引物设计啦，可以把相应的cDNA序列下载下来，方法如下图。

4. 引物的设计

在Analyse this sequence 列表中找到Pick Primers单击，方法如下，进入引物设计页面。当然也可在NCBI首页的下部找到Primer-BLAST，单击进入相同的页面。

5. 然后将PCR product size 设置为100~200bp，返回的引物数这里保持默认的10对，退火温度保持默认。

6. 关于引物的跨内含子设计主要是为了避免cDNA的PCR过程受到基因组DNA的影响，引物是否跨内含子设计以及引物的特异性检测，这里保持默认设置即可，点击Get Primers 提交任务 。

7.此外，Primer-BLAST也可以用来设计常规PCR的引物。

方法3：

PrimerBank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。

1. 在Pubmed上找到该基因的详细信息

2. 打开PrimerBank，对应输入，点击Submit。选择NCBI Gene ID(即上图第二个框线标注的内容)

3. 得到如下图所示，可优先选择已确认序列

来源：废柴一枚

转自：“斐然智达SCI学术服务”微信公众号

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