大家好，今天给大家带来的是一篇2022年1月发表在Front Oncol上文章。

作者以“MECOM 和 PRDM16是两个与许多恶性肿瘤高度相关的锌指转录因子。然而在肺腺癌 (LUAD) 预后和肿瘤免疫浸润中的机制仍不确定”为研究背景展开研究。

作者分析了 MECOM 和 PRDM16 在 LUAD 中的表达，并在各种数据库的基础上研究了这两个基因与 LUAD 患者临床病理特征、预后、免疫细胞浸润和免疫细胞标志物的相关性。最后，通过定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 在 LUAD 患者中进一步验证 MECOM 和 PRDM16 的表达水平。

Front Oncol. 2022 Jan 31;12:772686.

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期刊简介

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研究思路

作者首先通过检索癌症基因组图谱（TCGA）、Oncomine、UALCAN、GEPIA 和 TIMER 数据库，以确定 LUAD 中 MECOM 和 PRDM16 的表达、临床病理特征、免疫浸润和预后之间的关系。

通过 CBioPortal 研究这两个基因的共表达基因，并通过 GO 和 KEGG 分析阐明了 MECOM 和 PRDM16 相关基因的潜在机制。

利用STRING数据库进一步构建共表达基因的蛋白-蛋白相互作用网络，并通过Cytoscape鉴定出hub基因。

最后，进行 qRT-PCR 以鉴定 LUAD 中 MECOM 和 PRDM16的 mRNA 水平。

研究方法及主要成果

1.MECOM和PRDM16在LUAD中表达下调

作者首先通过Oncomine和 TIMER 数据库探索多种肿瘤和邻近正常组织中 MECOM 和 PRDM16 的 mRNA 水平（图1）；

进一步评估 TCGA 数据库中的 594 个样本和 57 对 LUAD 及邻近非癌组织，发现 MECOM 和 PRDM16 在 LUAD 组织中的表达在正常组织中显着降低( 图 2A、B、D、E)；

CBioPortal 数据库是一个开放平台综合数据，来自包括 TCGA 在内的多个数据库，用于研究 MECOM 和 PRDM16 表达及其甲基化水平之间的相关性（图 2C、F）。结果表明：这两个基因的低表达与其DNA的高甲基化水平有关。

图1.MECOM 和 PRDM16 在各种肿瘤中的表达。

(A) Oncomine 数据库中各种肿瘤中 MECOM 和 PRDM16 的表达。Oncomine 的结果显示：与正常组织相比，MECOM 和 PRDM16 在肺、乳腺、胃、肉瘤和肾肿瘤中的表达均下调；

(B, C) MECOM (B)和 PRDM16 (C)在 TIMER 数据库中各种肿瘤中的表达。TIMER结果显示：LUAD 和肺鳞状细胞癌 (LUSC) 中也发现了 MECOM 和 PRDM16 表达的下调；

图2.MECOM 和 PRDM16 在 LUAD 中的表达。

(A, D) TCGA 中 LUAD 组织中MECOM (A)和 PRDM16 (D ) 的 mRNA 水平。

(B, E) TCGA 中 57 例 LUAD 患者配对肿瘤和邻近正常组织中MECOM (B)和 PRDM16 (E) mRNA 表达水平。

(C, F) cBioPortal 数据库中 MECOM (C)和 PRDM16 (F) mRNA 表达及其甲基化水平在 LUAD 中的相关散点图。结果表明：这两个基因的低表达与其DNA的高甲基化水平有关。

相关学习：

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2.MECOM 和 PRDM16 与 LUAD 患者的临床病理学特征和预后相关

研究方法：

作者下载的TCGA数据通过R“limma”和“survival”包分析，探讨MECOM和PRDM16在LUAD、正常组织和不同临床特征中的表达，以及MECOM、PRDM16和 LUAD 生存 (OS)的相关性。

随后，通过UALCAN 和 GEPIA进一步分析了 MECOM、PRDM16、临床病理学特征和无病生存 (DFS) 之间的关联。

结果表明：

MECOM和PRDM16的低表达与LUAD的病理分期差、淋巴结状态高、OS差有关（图 3A、B和4A，C）；

而 MECOM 和 PRDM16 的表达对 LUAD 的 DFS 没有影响（图 4B、D）；

此外，在 UALCAN 数据库中还发现 MECOM 和 PRDM16 与年龄、性别、种族、分期、吸烟状况、组织亚型、TP53 突变和淋巴结转移状况相关（表 S4和S5，均p  < 0.05，详可见文章原文链接） 。

图3.MECOM (A)和 PRDM16 (B)在 LUAD 患者不同临床病理特征中的表达水平。

图4.MECOM和PRDM16的表达与LUAD预后的相关性。(A, B) LUAD 中MECOM、OS (A)和 DFS (B)之间的相关性。(C, D) LUAD 中PRDM16、OS (C)和 DFS (D)之间的相关性。

3.MECOM 和 PRDM16 在 LUAD 中的表达与免疫细胞浸润有关

研究方法：

作者通过“CIBERSORT”R包获得TCGA的每个LUAD样本中的免疫细胞表达情况，将结果通过“Barplot”和“Corrplot”R包可视化。

LUAD 中 MECOM 和 PRDM16 高表达和低表达患者之间不同免疫细胞的表达通过“limma”包进行研究，并通过“Vioplot”包进行可视化。

结果表明：

一些免疫细胞在 MECOM 和 PRDM16 高表达和低表达的 LUAD 患者之间存在差异表达（ 图 5A、B）。

MECOM 与幼稚 B 细胞、静息肥大细胞、活化 NK 细胞、活化树突细胞、浆细胞和静息记忆 CD4 T 细胞之间存在显着的正相关关系。MECOM 与巨噬细胞 M0 和 M1、激活的肥大细胞、静息 NK 细胞、激活的记忆 CD4 T 细胞和 Treg 呈负相关（图 6A）。

PRDM16与单核细胞、静息肥大细胞、静息和活化的树突状细胞、活化的NK细胞、静息记忆CD4 T细胞和Tregs之间存在正相关关系。而PRDM16与巨噬细胞 M0 和 M1、静息 NK 细胞、活化记忆 CD4 T 细胞、嗜酸性粒细胞和 CD8 T 细胞呈负相关（图 6B）

图5.MECOM (A)和 PRDM16 (B)高表达和低表达的 LUAD 患者中免疫细胞的表达。

图6 .MECOM (A)、PRDM16 (B)表达与 LUAD 中免疫细胞浸润水平之间的相关性。

4.MECOM 和 PRDM16 相关的免疫细胞与 LUAD的预后相关

TIMER 数据库的结果模块研究了基因表达和免疫细胞浸润对 LUAD 患者生存的影响。

研究方法：

作者利用TIMER数据库构建Kaplan-Meier图，探讨MECOM和PRDM16的表达与相关免疫细胞在LUAD预后中的关系。

通过R包的Spearman相关分析分析MECOM和PRDM16与LUAD中免疫细胞浸润的相关性。

图7.LUAD 中 MECOM- (A)和 PRDM16 相关(B)免疫细胞表达与预后之间的相关性。

图A：MECOM 的高表达和 B 细胞、肥大细胞和髓样树突状细胞浸润水平高的患者与更好的预后相关；MECOM低表达和 CD4 + T 细胞浸润水平高的患者预后较差。

图B： PRDM16的高表达和 Treg、肥大细胞和髓样树突状细胞浸润水平高的患者与良好的预后相关。PRDM16 的低表达和高 CD4 + T 细胞浸润水平与 LUAD 的不良结果相关。

5.MECOM 、 PRDM16 与免疫细胞标志物表达的相关性

作者利用TIMER数据库的Gene_Corr模块以研究两个基因的表达与特定免疫细胞亚群的生物标志物之间的关系。

表1：TIMER中MECOM、PRDM16与免疫细胞基因标志物的相关性分析。

MECOM 与单核细胞 (CD86)、M1 巨噬细胞 (NOS2)、M2 巨噬细胞 (COX2) 、中性粒细胞 (CD66b、CCR7)、NK (KIR2DL4)、DC (HLA-DPB1, CD1C)、Th1 (STAT1, IFNG), Th2 (STAT6, STAT5A), Tfh (BCL6), Th17 (STAT3), Treg (STAT5B)、T 细胞耗耗竭 (PD-1, LAG3, HAVCR2, GZMB)标志物之间存在显着相关性；

PRDM16 与 CD8 + T、单核细胞、M2 巨噬细胞、中性粒细胞、DC、NK、Th1、Th2、Tfh、Th17、Treg 和 LUAD 中的 T 细胞衰竭的标志物密切相关。

6.MECOM 、 PRDM16 共表达基因的鉴定

使用 CBioPortal 数据库分析 MECOM 和 PRDM16 的共表达基因（共表达标准：|r| > 0.4 和 p < 0.001），并使用 R 的“heatmap”包生成热图。然后利用 R 的“VennDiagram”包，通过韦恩图进一步探索MECOM 、 PRDM16 的交叉共表达基因（共137个）。

图8.cBioPortal 数据库中 LUAD 中MECOM (A)和 PRDM16 (B)的前 15 个共表达基因。(C) 维恩图显示MECOM 和 PRDM16 的交叉共表达基因。注意：带有 |r| 的基因 > 0.4 和p  < 0.001 被认为是共表达基因。

相关学习：

韦恩图可参考：

①【科研猫·绘图】缤纷版·韦恩图（带R代码分享）

② 不用R，三分钟搞定韦恩图

热图可参考：

①【科研猫·绘图】今夏最热的“热图”（带R代码分享）

②【高阶绘图】相关性热图，这样画才好看！

③ 韦恩图+热图 hiplot

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7.GO、KEGG分析

作者通过 R的“clusterProfiler”包的 GO 和 KEGG 分析，研究了受 MECOM 和 PRDM16 共表达基因影响的生物学功能和信号通路。

图9.MECOM (A, B)和 PRDM16 (C, D)共表达基因和共表达基因交叉(E, F)的 GO 和 KEGG 分析。

图 A、C、E：GO 分析阐明 MECOM 和 PRDM16 的共表达基因主要参与有丝分裂、DNA 复制和细胞器分裂。

图 B、D、F：KEGG 分析发现共表达基因在调节细胞周期、细胞衰老、DNA 复制和 p53 信号通路方面富集。

相关学习：

GO/KEGG的学习可以参考系列推文：

①3分钟了解GO/KEGG功能富集分析；

②干货预警：3分钟搞定GO/KEGG功能富集分析（2）；

③终极篇：3分钟搞定GO/KEGG功能富集分析-气泡图。

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8.PPI网络中与MECOM、PRDM16相关的hub基因

研究方法：

作者通过STRING数据库构建MECOM和PRDM16共表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。

随后，使用Cytoscape 的 CytoHubba 插件确定了前 10 个hub基因。

最后，通过 GEPIA 数据库研究了 LUAD 中 hub 基因的表达及其与 OS 和 DFS 之间的关系。

研究结果：

PPI网络分析共鉴定出10个hub基因（CDK1、CDC20、BUB1、CCNA2、CCNB2、AURKB、CCNB1、KIF2C、CDCA8、TOP2A）（图 10A、B;表 2）

图10.MECOM和PRDM16交叉共表达基因构建的PPI网络。(A) PPI 网络。(B) PPI 网络中的十个hub基因。除蓝色外，前 10 个hub基因以不同的颜色显示。

表2.蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络中的前 10 个hub基因.

进一步，GEPIA 数据库观察到hub基因在 LUAD 中升高并且与较差的 OS 相关（图 11A-J和12A-J）。

图11.GEPIA 数据库中 LUAD 中前 10 个hub基因的表达：CDK1 (A) , CDC20 (B) , BUB1 (C) , CCNA2 (D) , CCNB2 (E) , AURKB (F) , CCNB1 (G ) , KIF2C (H) , CDCA8 (I)和 TOP2A(J) 。

图12.GEPIA数据库中LUAD患者前10位基因与OS的相关性。CDK1 (A)、CDC20 (B)、BUB1 (C)、CCNA2 (D)、CCNB2 (E)、AURKB (F )、CCNB1 (G)、KIF2C (H)、CDCA8 (I)和 TOP2A (J) .

此外，CDK1、AURKB、BUB1、CCNB1 和 CCNB2 也被证明与 LUAD 患者的 DFS 相关（图 S3）。

表3.GEPIA数据库中LUAD患者前10位hub基因与DFS的相关性。CDK1 (A)、CDC20 (B )、BUB1 (C)、CCNA2 (D)、CCNB2 (E)、AURKB (F)、CCNB1 (G)、KIF2C (H)、CDCA8 (I)和 TOP2A (J)。

相关学习：

PPI的学习可以参考系列推文：

①【科研猫】网络图：基因互作-关键基因（1）

②【科研猫】网络图：基因互作-关键基因-带视频（2）

③【科研猫】网络图：基因互作-关键基因-带视频（3）

④【科研猫】网络图：基因互作-关键基因-带视频（4）

⑤【科研猫】网络图：基因互作-关键基因-带视频（5）

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9.验证LUAD组织样本中的MECOM、PRDM16表达

样本收集：

本研究共收集 2020 年 7 月至 2021 年 3 月西安交通大学第一附属医院（中国陕西）病理证实的原发性 LUAD 患者 10 例。所有患者均未接受放疗和/或化疗，并且没有其他癌症病史。

研究方法：

通过 qRT-PCR 在 LUAD 患者组织中评估 MECOM 和 PRDM16 的 mRNA 表达。

研究结果：

如图13A-D所示：与邻近的非癌组织相比，MECOM和PRDM16在LUAD患者的原发性肿瘤组织中均下调（p  <0.05），这与生物信息学分析的结果一致。

图13.LUAD临床样本中MECOM （A，B）和PRDM16 （C，D）的mRNA表达。

小结

本研究的优点在于首次探讨了两个高度相关的 PRDM 成员 MECOM 和 PRDM16 的表达，以及它们与 LUAD 患者预后和免疫细胞浸润的相关性。重要的是，该结果在临床样本中得到了进一步验证。然而，仍然存在一些局限性：（i）临床样本的样本量不足，（ii）没有进行分子生物学实验来研究这两个基因在 LUAD 中的功能。考虑到这两个基因在 LUAD 的预后和免疫细胞浸润中的重要性，未来值得进一步研究这两个基因在调节 LUAD 发生发展中的作用机制。

通过这篇实际的例子，我们看到，通过数据分析发表一篇6分的SCI文章还是比较简单的，而且都是“套路”，只要学会这些套路，做起来是非常省时省力的。如果在专业的技术人员带领下学习，上面的事情做起来都会是事半功倍。

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