对于科研工作者而言，“实验方案”这四个字应该不会感到陌生吧！对于课题实验而言，一个好的实验方案是成功的关键因素，会起到事半功倍的效果。虽然只有简短的四字，但有时候却让人焦头烂额，不知道从何入手。小编不才，借此机会简要的理一下思路，抛砖引玉。如有“大牛”经过，烦请指点一二。

目前，生物医学方向的研究热点依然逃脱不了miRNA、lncRNA以及circRNA三大系列，绝大部分都是与癌症或肿瘤有关联，在人体内的作用机制还没有得到完整的阐述，有待进一步的深入研究。接下来本文以miRNA为例，来设计一个实验方案。

【随便选取一个miRNA以及某种癌症】----以miRNA-142-5p和肺癌为关键词。

一、明确研究对象：miRNA-142-5p，肺癌。

有了这两个对象还不够，还缺少一个重要的因素，那就是miRNA-142-5p的靶基因，因为miRNA一般都是通过作用靶基因来作用于癌症。

1、靶基因预测

通过靶基因预测网站，我们得知miRNA-142-5p的靶基因有很多，这时小伙伴们是不是有个疑惑，这么多靶基因，我该选哪个呢？不要慌，小编教你一个方法：因为主题是与癌症肿瘤相关，因此我们可以查找与cancer/tumor相关的靶基因。通过刷选，我们得知miRNA-142-5p的靶基因为FAT3、TP53INP1和TNFAIP3。

靶基因预测工具：

microRNA.org

http://www.microrna.org/microrna/home.do

TargetScan

http://www.targetscan.org/vert_61/

miRcode

http://www.mircode.org/index.php

miRDB

http://www.mirdb.org/cgi-bin/search.cgi

RNA22

https://cm.jefferson.edu/data-tools-downloads/rna22-full-sets-of-predictions/

PITA

https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html

2、双荧光素酶报告基因检测——验证预测的靶基因

二、对象明确后，接下来就要开始进入正题了。。（实验方法）

一般而言，与肿瘤或癌症相关的实验方法包括三部分：临床实验、细胞实验以及体内实验（小鼠造模）。

?

临床试验

选取肺癌组织及其邻旁健康组织（对照组），通过RT-qPCR检测组织内miRNA-3156-5p的表达，以观察miRNA-142-5p在肺癌组织中是高表达还是低表达。

?

细胞实验

1、细胞系

肺癌细胞系：H460、A549、HCC827、H1975和H1299；正常肺上皮细胞系：BEAS-2B和HBE。采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。

2、VZET和EMT相关基因的表达情况分析

在肺癌细胞系和正常的肺上皮细胞系中利用RT-qPCR 和Western blot检测miRNA-142-5p、FAT3、TP53INP1和TNFAIP3等相对表达量。

3、转染

以对数生长期的肺癌细胞/正常的肺上皮细胞为转染对象，转染miRNA-142-5p（实验组）【实验组分为miRNA-142-5p过表达组（pc-miRNA-142-5p）和敲低组（siRNA）】，阴性对照组（siNC、pcNC)，以及空白对照组

【分为5组：siRNA、pc -miRNA、siNC、pcNC、Control group】。

其中关于敲低/沉默组（siRNA），可以设计两到三条对应siRNA序列。

4、RT-qPCR和Western-blot

检测转染miRNA-142-5p后靶基因（FAT3、TP53INP1和TNFAIP3）的表达情况。

5、转染后要检测miRNA-142-5p对细胞的影响，论文中常见的一些细胞实验包括细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、自噬等，但各自采用的方法却不一样，接下来就简单的介绍一下：

细胞增殖——MTT/MTS/CCK-8等实验；

细胞迁移和侵袭——Transwell实验/划痕愈合实验；

细胞凋亡——流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期、Caspase3/7活性检测、ROS（活性氧）检测、MMP（线粒体膜电位）检测等；

细胞自噬——通过免疫组化/western-blot检测自噬相关标志物（LC3和Beclin-1）的相对表达量。

6、相关信号通路分析——细胞凋亡和自噬过程都是伴随着相关的信号通路（singling pathway）。

Caspase-3/Caspase-9 singling pathway：

细胞凋亡被认为是抑制细胞生长的一种方法，Caspase-3/-9是细胞凋亡的两个关键成员。凋亡相关因子包括Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2和Bax。Western-blot和RT-qPCR检测对应的蛋白或mRNA：Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax。

PI3K/Akt/mTOR singling pathway：

PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤中研究较多。在转染miRNA-142-5p后，结合相关通路抑制剂或激活剂（PI3K的抑制剂：LY294002；mTOR抑制剂：雷帕霉素（RAP）；PI3K/Akt/mTOR通路的激活剂：胰岛素insulin），通过western-blot检测相关蛋白的表达量，包括Akt、p-Akt（磷酸化）、mTOR、p-mTOR。

?

动物实验

成瘤实验（Tumor formation assay）——小鼠体内实验【实验验证】

从肺癌细胞系中找出miRNA-142-5p表达最低的那个细胞系，然后过表达miRNA-142-5p；或者找出miRNA-142-5p表达最高的那个细胞系，然后进行RNAi技术，敲低/沉默miRNA-142-5p。

转染的细胞通过皮下注射到BALB/c裸鼠中，15 d左右后，处死小鼠，收获肿瘤并测量肿瘤的重量及大小。

理论上讲，实验方法越多，内容越饱满，相对而言越容易发高分的文章，当然，这还得考虑个人实际情况，尤其是基金的预算以及您想要发几分的文章，不可盲目。。。

关于几分的文章对应哪些实验方案，在这里小编简单的介绍一下：

0-1

单个细胞系，单组转染miRNA（根据细胞系中miRNA的表达情况来确定是过表达还是敲低转染），做一些简单的细胞实验即可（细胞增殖、迁移/侵袭、细胞凋亡--流式细胞检测凋亡率）。

1-3

临床组织样本和多个细胞系（2-3个），单组转染miRNA（根据细胞系中miRNA的表达情况来确定是过表达或者敲低转染），丰富相关细胞实验，比如说细胞凋亡，除了利用流式细胞仪检测细胞凋亡率之外，还可以检测细胞周期、Caspase3/7活性、MMP检测、ROS检测等。

3-5

临床组织样本和多个细胞系（3-5个）；两种miRNA转染形式：过表达和敲低/沉默（其中siRNA可以设计2-3条对应序列）；研究相关信号通路以及动物实验（小鼠成瘤）验证miRNA的作用。

5-7

这算是一个高分文章了，所以思路相对要变一点，不能按照传统模式下去。与5分以下文章相比，除了一些常规的研究之外，具有一个很重要的创新点：利用生信分析——基因表达微阵列（Gene expression microarray assay）检测肿瘤组织与邻近正常组织差异表达的miRNA和基因，通过表达以及敲除/沉默两种手段进行转染miRNA或相对应的基因。除此之外，在细胞系以及细胞实验方法的选择上也更多，以及相关的信号通路研究和小鼠成瘤验证实验也是必不可少的。

不管您发几分的文章，有几个实验环节是必不可少的，第一个就是靶基因的预测和双荧光素酶报告基因检测；第二个就是RT-qPCR和western-blot，检测相关mRNA和蛋白的表达情况。

? END ?

来源：南博屹生物

转自：“斐然智达SCI学术服务”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！