阅读: 2023/1/5 17:45:13
科研人习惯把 WB 叫做「玄学」,一不小心很容易出现问题!明明上了两个相同体积的同个样品,可总是这两个泳道的条带趋势不一致。
我们给大家准备了图解 WB 标准操作流程,注意事项和相关解决方案,帮助大家轻松获得可靠、线性、定量的实验结果。
一、实验操作视频
现在不便观看视频的同学,可以先收藏小程序,另外,丁香实验还给大家准备了文字版本的操作步骤,接着往下看吧
二、实验具体步骤
细胞裂解进行蛋白提取的步骤同 COIP 细胞裂解的步骤。
制胶:电泳的过程中需要配置分离胶和浓缩胶,每一个胶板大致配 7~8mL 的分离胶,3~4mL 的浓缩胶。将配置好的分离胶加入到两玻璃之间,注意加入的位置,然后在其上加入 75% 的乙醇,待其自然凝固后将其中的乙醇倒掉,用水轻轻地冲洗,再将浓缩胶倒入其中让其慢慢凝固。
为了防止电泳过程中条带的弯曲,在安装电泳仪之前要用两个胶板固定使其平衡。玻璃板低的一侧朝向里面,注意电极正负,电泳之前要在电泳槽中倒入电解液。
上样之前要进行上样量的计算,要使所有样品的上样量都保持一致,控制单一变量。上样之前需要煮沸样品,使蛋白裂解。煮沸过之后用小的离心机稍微离心。
上样及电泳:先加入 Buffer,然后依次加入样品,最后加入 2~3 μL 的Marker。打开电源,调至电压至 100V,待 Marker 条带分明时,然后将电压调至 150V,至 Marker 中的红色条带跑到下面为止。
转膜:膜需要先用甲醛进行活化,电转液需要提前配置进行预冷。转膜之前膜和胶之间不要有空隙。
封闭完之后,加入抗体进行封膜处理,封膜 1 h。
取出膜用 TBST 洗 3 次,每次 10 min。
加入二抗进行孵育,孵育 1 h 后使用 TBST 清洗三次。
暗室显影:加入和二抗结合的 AB 液,在发光仪中显色。
三、WB实验注意事项
1. 电转液需要提前遇冷;
2. 电转的过程中的电流不能过高;
3. 孵育抗体的时候要提前将气泡赶走;
4. 孵育一抗尽量在 4℃ 环境下进行;
5. 发光在暗室里进行。
转自:“丁香学术”微信公众号
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