一、抗体的保存

浓缩抗体，在有效期以内，一般只需放在普通4 ℃冰箱内保存，保存时间可达5-10年以上（免疫荧光试剂例外）。最好不要用塑料管分装，因为塑料对抗体有吸附作。用-20℃至-40℃低温冰箱冷冻，避免反复冻融使抗体效价降低。而即用型抗体保存时间一般在一年以内。

用TBS稀释的抗体，一般可放置1个月。稀释比低的抗体，效价降低比较快一点，如CD系列、bcl-2、Ki-1、syn、5-HT等等；而稀释比高的抗体，如CEA、KT、CgA、CT、AFP、GFAP、S-100等等。

二、非特异性着色的原因

1．抗体稀释度过高，导致切片深染。

现象：分不清是那些细胞着色。

解决方法：找出最佳的稀释比。

2．抗体不纯，或抗体特异性不强，交叉反应较多，或抗体表达较弱。

现象：阳性细胞和阴性细胞都着色，只是阳性细胞着色略强一些。

解决方法：像这类情况很难有好的办法解决，可找一个背景着色较浅的试剂盒试一下，或用胰酶消化，或用微波修复。

3．抗体本身的特异性异常表达。从理论上说一种抗体只能与其相应的抗原起免疫反应，但经过长时间实验以后，发现很多组织都有“例外”的表达，目前大多用细胞的分化不同阶段其抗原性有相应的变更来解释，可能还有很多我们目前不知的原因。

解决方法：暂无。

4．抗体孵育时间过长，或孵育温度过高，导致着色过深。

解决方法：调整孵育时间和温度。

5．抗原修复不正确。

解决方法：再次确认修复操作。

三、背景着色的原因

背景着色和非特异性着色有时没有一个明确的界线，现象都是背景黄。

1．内源性过氧化物酶丰富，如肝脏。解决办法：用APAAP试剂盒可能好一点。

2．切片在染色过程中干燥过，特别是在孵育的过程中干燥。无法补救。

3．粘贴剂浓度过高。解决办法：再稀释。

4．抗体浓度过高，或抗体浓度过低。解决办法：找出合适的稀释比。

5．显色剂浓度过高，或显色时间过长。解决办法：显色剂称量要准确，并找出合适的浓度，显色时镜下控制。

6．缓冲液洗涤不够干净。解决办法：多清洗一点时间，减少从上一缸带到下一缸的残液，缓冲液每次用过都要更换。

7．浸蜡温度过高，烤片温度过高或烤片时间过长。解决办法：用60℃以下的温箱浸蜡和烤片，烤片时间在4～8小时内。

8．福马林固定时间过长。解决办法：流水冲洗。

四、着色不匀的原因

1．脱蜡不干净。

2．抗体或显色剂加的太少，有的地方没覆盖到，或有的部位已干燥。

3．显色剂（DAB）用前没过滤。

4．湿盒不平，导致切片倾斜，有的部位已干燥。

5．抗体稀释时没打匀。

6．抗体发霉，或稀释抗体用的缓冲液发霉。

五、出现假阴性的原因

1．固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。

2．固定液不合适，或浓度不对，导致固定不佳。

3．第一抗体没加。补救办法：染过的片子用缓冲液洗干净后，再加一抗，按步骤重新染过。

4．第一抗体加错。如加错的抗体和你要加的抗体是不同类型的二抗，那原片子用缓冲液洗干净后，再加一抗，可能还能补救。

5．二抗没加，或二抗加错。补救办法：染过的片子用缓冲液洗干净后，再加二抗，关系不大。

6．DAB显色剂里双氧水没加，现象是全部不着色，加双氧水后再显色。

7．抗体浓度过低。补救办法：增加抗体浓度，染过的片子用缓冲液洗干净后，加一抗再染。

8．孵育的时间太短，没按要求时间孵育，从一抗开始重新染过。

9．孵育温度太低。解决办法：保证温箱温度在37℃，或增加孵育时间，如一抗4℃过夜。

10．抗体本身的特异性。有的抗体在正常组织中表达很强，而肿瘤时表达很弱，或不表达。

11、修复方法有误，或处理时间不正确。

12、缓冲液pH值不正确。

参考文献：

1．王伯沄，李玉松，黄高升，张远强《病理学技术》

2．凌启波《实用病理特殊染色和组化技》

3．刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》

来源：基因科技

转自：“斐然智达SCI学术服务”微信公众号

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