来源：科研小白的进阶之路

经典基因敲除有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩，或实验动物因出生后严重的生理缺陷而过早死亡，或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。这些，可以通过条件性基因敲除或敲入（conditional knock out or knock in）而避免，即在特定的组织细胞或细胞发育的特定阶段敲除或引入某一特定基因，对研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能有着重要意义。

目前常用Cre/LoxP、Flp/FRT重组系统。

Cre-LoxP基因敲除系统

Cre重组酶

1981年从P1噬菌体中发现，Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码有343个氨基酸组成的38kDa单体蛋白。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线性、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组，活化或沉默兴趣基因。

利用Cre/LoxP和来自酵母的Flp/FRT系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的loxp，并以此两侧装接上loxp的（loxP floxed）ES细胞产生“loxP floxed”小鼠。然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交（也可以用其他方式向小鼠中引入Cre重组酶），产生靶基因发生特定方式（如特定的组织特异性）修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧一个装上了一个loxP，但靶基因没有发生其他的变化，故“loxP floxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的自带中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的loxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。这样，靶基因的修饰（切除）是以Cre表达为前提的。Cre表达特异性决定了靶基因的修饰（切除）特性，即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰（切除）就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

LoxP序列

Loxp片段好似路标，在说：“切断两个路标之间的DNA”

是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：

5‘-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3'

3'-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5'

Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组过程

如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间序列倒位。

如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。

Cre-loxP系统的特点

LoxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成

Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用

Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控下，从而使这种重组酶在生物体的不同细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。

传统基因敲除技术的缺点

knockout小鼠的所有细胞基因组上都存在基因的缺失/突变，往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能的分析。

即使发育完整的突变体小鼠，对于knockout表型的解释常遇到两个困难问题：一是所有体细胞基因的剔除，很难将异常的表型归于那一类的细胞或者组织；二是很难排出在成熟动物上由于发育缺陷所引起的异常表型。

新霉素抗性基因（neo）和单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因（HSV-tK）为正负选择（positive and negative selection）系统，是筛选和富集同源重组细胞广泛应用的方法 ；该方法虽然使基因打靶技术可适用于任何外源目的基因，但也有一个严重的缺陷，即发生同源重组的细胞基因组中总留有选择标记（neo）基因，该基因可能影响相邻基因的表达，不利于对突变表型的精确分析。

以Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因敲除技术可克服上述的局限性。

借助Cre-LoxP系统的条件性基因敲除

一般情况下，利用Cre-LoxP系统进行基因操作时，会采用两种转基因动物进行杂交，即一种带Cre的转基因动物和一种带LoxP序列的转基因动物进行交配，使得后代既带Cre又带LoxP基因，然后Cre重组酶会识别LoxP位点，导致基因重组。启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。

借助于Cre-LoxP系统的诱导性基因敲除

目前应用于时间特异性基因敲除动物模型的诱导剂大多通过与四环素操纵子（teto）的相互作用来完成诱导过程。

在没有四环素类药物诱导时，四环素控制的转录激活蛋白（tTA）与tet操纵子（teto）结合，下游基因发生转录。有四环素时，这种结合消失，下游基因不能转录。

而逆向四环素转录激活蛋白（rtTA）则功能相反，在有四环素时，rtTA与tet操纵子（teto）结合，下游基因发生转录。

转基因动物依赖的Cre-LoxP系统在应用中遇到的问题

转基因动物难以获得：有很多Cre/LoxP转基因动物没有被制作出来，自己制作转基因动物耗时且成本高。

动物交配很耗时间：转基因动物达到实验时候，首先需要将转基因动物的数量扩大，然后经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2个月时间，所以至少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠

区域或者组织特异性不高：因为转基因小鼠以来的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的调控，二有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求，这样就会使实验结果不精确。

改良的Cre-LoxP系统：病毒依赖的基因重组

通过病毒引入Cre或LoxP元件，结合一种转基因小鼠是比较常用的方式。

病毒依赖的Cre-LoxP系统的优点

更强的区域特异性：由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染，再加上驱动Cre基因的特异性启动子，能够实现更强的区域和细胞特异性的基因重组。

更少的花费：购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的，而且转基因动物的饲养、即银行间定都需要不少的人力、物力，而病毒的制备、保存和注射所花的费用相对来说是比较少的。

更短的实验周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而转基因小鼠的交配过程特别耗时间，因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式，可以大量缩短实验周期。

Cre／loxP系统的工作流程

采用Cre／loxP系统是腺体内某特定基因子特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的自带小鼠就会在某一特定类型的细胞中确实某一特定的基因。

在何种组织细胞或器官中翘楚某一特定的基因取决于所选择的启动子。只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。这些启动子可以是细胞类型特异的，如lck启动子（胸腺细胞）、alphaA晶状体球蛋白启动子（眼睛状体）、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子（海马和大脑新皮质）、乳清酸性蛋白启动子（乳腺）、aP2启动子（脂肪组织）、AQP2启动子（肾脏集合管）和肌浆蛋白启动子（骨骼肌）。

启动子也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用，如干扰素反应Mxl启动子、tamoxifen依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。

构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。

构建Cre转基因动物

胚胎干细胞的囊胚注射法

选择合适的载体，将Cre重组酶的编码基因与其重组，构建重组质粒

重组质粒线性化后，用电穿孔、脂质体等方法将其转入体外培养的小鼠胚胎干细胞中。

体外筛选稳定整合外源基因的胚胎干细胞

筛选出的胚胎干细胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育为一个完整胚胎

产出的嵌合体小鼠通过杂交，最终获得稳定整合Cre重组酶的纯合体转基因小鼠。

受精卵雄性原核显微注射法

准备假孕母鼠：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。

受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（HCG），以促使其超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。

基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。

胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟

对幼鼠的鉴定：（1）幼树发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针做分子杂交，鉴定外源基因是否整合

（2）建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%概率 带有整合的基因供实验用。也可将适合的组织进行细胞培养，建立细胞系。

（3）自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，以鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫测定（RIA）等。亦可取胚胎进行分析。

loxP转基因动物的构建

loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。

该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体，这种载体主要由3个部分组成：

分别存在于打靶载体5‘和3’臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。

位于5‘和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲入的外源序列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo-2A基因，含有两个选择标志：一个为G418抗性基因（neo)，为细胞提供针对G418的抗性，为正筛选标记，另一个为胸腺嘧啶激酶基因（tk），可以把培养基中的更昔洛韦（ganciclovir）磷酸化为对细胞有毒的化合物，为细胞提供负筛选标记

3个loxP位点，分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基因的两侧

一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞，常选用位于同源序列边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取代型打靶载体整合进基因组的结果是打靶载体中的序列置换掉基因组中的同源序列。

loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转移法。在这个过程中，首先要构建具有3个loxP位点的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下：选择标志基因（neo-2A）的两侧各一个，从而能够是选择标志基因在Cre的介导下消失，以避免它们在基因组中的存在可能给转基因动物造成危害；与其要进行敲除的基因两侧各一个，在Cre的作用下可以介导目标基因的敲除。在载体构建成功后，用电穿孔等方法将其导入到胚胎干细胞中，使其以同源重组的方式整合进干细胞的基因组，之后经G418筛选，用PCR和DNA印迹（Southern blotting）等方法来确定靶基因是否发生了同源重组。最后，为了去除筛选标志基因，要向上述的胚胎干细胞中导入Cre瞬时表达质粒。这时，在Cre的作用下，具有3个loxP位点的靶基因区域会产生3种后果：

发生Ⅰ型缺失，3个loxP之间的所有基因（靶基因和选择标志基因）全部被切除，只保留1个loxP

发生了Ⅱ型缺失，只有选择标志基因被切除，两个loxP位点及其之间的靶基因被保留。

发生了Ⅰ型缺失或Ⅱ型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生长，在用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变结果进行鉴定。

Ⅲ型缺失，靶基因被切除而选择标志基因被保留，发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。经过更昔洛韦培养基筛选后可以筛选出发生Ⅱ型缺失的胚胎干细胞。在用囊胚注射法将经过这种遗传改造的胚胎干细胞注入囊胚，最后移植入代孕母鼠的子宫内，获得具有Ⅱ型缺失突变的转基因动物，在其基因组中特定的基因位置具有两个loxP位点。

FLP-FRT系统基因敲除系统

该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中．重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序列如图所示。

基于Cre／loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统

该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet-Off（tTA依赖）系统和Tet-On（rtTA依赖）系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子pTEC的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的集合是不需要四环素的，四环素阻碍两者之间的相互作用；而rtTA与启动子Ptet的相互结合只有在四环素或者其衍生物多西环素（强力霉素）存在的情况下才会发生，没有四环素或者多西环素时，两者不发生相互作用。因此这两个系统以相反的方式对四环素进行反应，成为两个互补系统。

该系统含有3个基本的要素：tTA或rtTA、Ptet、四环素或多西环素。其中tTA或rtTA作为一种转录因子是一个融合蛋白，具有两部分：一部分为来源于原核生物体内的四环素阻碍蛋白（Tet repressor, Tet R）;另一部分为来源于真核生物体内，是真核细胞内转录因子的转录激活结构域，应用最为广泛的是单纯疱疹病毒编码的VPI6的酸性结构域。这两部分构成的融合蛋白（tTA或rtTA）可以受四环素或其衍生物的调节而发生构象变化，从而改变与相应的DNA序列（四环素抗性原件，Tet resistance operon, TetO）的结合能力。tTA或rtTA的另一个功能就是转录激活功能，当其在真核细胞内与相应的DNA反应元件结合后可以启动下游基因的转录。rtTA与tTA相比有几个氨基酸位置的突变，突变的结果是两者对四环素反应后产生的效应完全相反。rtTA只有在四环素存在的情况下才能与反应原件Tet O相结合，而tTA只有在四环素不存在的情况下才能与TetO结合。在具体的应用中，tTA或rtTA被置于特定启动子的调控下，以实现其在特定组织器官中进行表达。

Ptet是一个手tTA或rtTA调控的启动子，含有一个RNA聚合酶Ⅱ启动子的最小功能单位和若干个TetO序列，该启动子只有与tTA或rtTA结合时才能激活下游基因的表达。因此，在应用过程中Ptet被用来调控Cre重组酶的产生。

四环素或多西环素作为Tet-on和Tet-off系统的效应剂，与tTA或rtTA相互作用从而调节它们与Ptet的亲和力。多西环素是四环素的衍生物，由于其具有毒性小、所用剂量小等优点，在实际应用中更为广泛。

Tet-on和Tet-off系统的作用机制

采用该系统进行条件性基因敲除时，要将启动子调控的tTA的表达载体转入小鼠体内，同时还要将受Ptet启动子调控的Cre重组酶的表达载体也转入到小鼠体内。这样一个转基因小鼠与LoxP的转基因小鼠进行交配，产生的子代小鼠中会在特定组织和器官中表达tTA，tTA再与Ptet结合后激活下游的Cre重组酶的表达，实现特定基因在特定组织中的敲除。如果在子代小鼠出生时就给予四环素，并且一直维持下去，特定基因的敲除就不会发生，只有在停止四环素的应用后才会发生该基因在特定部位的丢失。

采用rtTA系统与上述情况正好相反，在不用四环素时基因敲除不发生，只有给予四环素时才会导致特定基因在特定部位的敲除。因此，该系统可以对靶位点的剔除或修饰进行时间和空间二维调控。

基于Cre／loxP系统建立的tamoxifen诱导条件性基因敲除系统

该受体将雌激素受体（estrogen receptor, ER）的配体结合去（ligand-binding domain, LBD）和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特意启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。为了消除内源性雌激素的影响，研究者将雌激素配体结合区进行了关键氨基酸的突变，从而使其不能与体内的生理性雌激素结合，而只能与外源性的雌激素类似物tamoxifen结合，这样就消除了内源性雌激素所造成的非特异性基因敲除。该系统与四环素诱导系统相似，也可以对靶基因的敲除进行时间和空间二维调控。利用该系统，schwenk等在1988年成功建立了B淋巴细胞特异启动子调控的E/1/SV40-CreERT转基因小鼠，并成功实现了tamoxifen的诱导，结果显示在B淋巴细胞中Cre介导的重组效率达到了80%

基因工程小鼠繁育方案

转基因小鼠

重点：转基因阳性小鼠与野生型小鼠交配

TG ×WT

这里说的转基因，并非广义上的所有的基因修饰，而是特指外源基因随机地整合到小鼠染色体上获得的随机插入转基因小鼠。

通过受精卵显微注射的方式，通常我们会获得很多个带有外源基因插入的首建鼠（Founder）。每一个首建鼠，外源基因插入的位置或次数都是不同的。所以每个首建鼠都应该自

成一系，也就是我们说的建系。

每一个 Founder 鼠分别与野生型（WT）小鼠（比如，常用的C57BL/6J）交配，获得的 F1子代；经过鼠尾基因型鉴定后，F1代中的阳性小鼠保留并再与野生型小鼠交配，获得 F2子代；F2代阳性小鼠保留再与野生型小鼠交配，获得 F3子代；以此类推。一个 Founder 鼠产生的子代，称为一个系。一般以 Founder 鼠的编号命名，比如：3号 Founder 获得的后代阳性小鼠，称为 3系。

F1代中可能出现一窝小鼠没有一只是阳性的情况。这是由于外源基因的整合可能发生在多细胞期，导致 Founder 小鼠中并不是所有细胞（包括生殖细胞）都有外源基因的整合，而是呈嵌合状态。先别急着扔掉这个 Founder 鼠，因为它仍然有可能是个阳性的 Founder，可以再试着多配几窝。除非你的 Founder 鼠多到用不完... Lucky you！

Founder 鼠之间不能相互交配。

通常转基因小鼠的基因型鉴定方法只能判断有无外源基因的整合（即阳性或阴性），并不能判断某特定位点的纯合或杂合。

阳性子代小鼠之间也不建议相互交配。

基因型阳性并不等于表达阳性，所以交配到F2代以上，还需要对每个系中的部分小鼠进行外源基因表达的检测，筛选到符合实验要求的转基因系。

基因敲除/敲入

重点：杂合子与杂合子交配，获得纯合子

+/- × +/- → -/-

对于采用 ES细胞打靶途径获得的基因敲除（KO）小鼠，在 Flp 重组酶去除 Neo 抗性基因以后，可以通过 KO 杂合子（+/-）之间相互交配的方式获得1/4 KO 纯合子小鼠（-/-）、1/2 KO 杂合子小鼠（+/-）以及 1/4同窝野生型对照小鼠（WT）。繁育流程如下图所示：

该路径同样也适用于基因敲入（KI）小鼠。

需要指出的是，对于利用 CRISPR/Cas9 介导的 NHEJ 途径获得的 KO 小鼠，情况有所不同，方案类似于转基因小鼠的繁育。由于 NHEJ DNA修复的结果是随机发生的，所以每一只 KO Founder 小鼠、甚至一只 Founder 中每个细胞的基因型都可能是不同的。因此，KO Founder 要与野生型小鼠（比如：C57BL/6J）交配，获得基因型明确的 F1子代 KO 杂合子（+/-）小鼠。随后，才能进行杂合子小鼠的相互交配。

不同的 KO Founder 之间不能相互交配。

不同的 KO Founder 的子代之间也不建议相互交配。

条件性基因敲除

重点：获得 flox 纯合同时 Cre 阳性的小鼠

（f/f；Cre-）×（f/+；Cre+）→f/f；Cre+

Flox 小鼠在去除 Neo 基因以后（CRISPR/Cas9 途径获得的 CKO 小鼠省略此步骤），获得仅含有两个 loxP 位点的 flox 杂合子小鼠（flox/+，可缩写成 f/+）。flox 杂合子（f/+）小鼠与组织特异性或诱导型 Cre 阳性（Cre+）小鼠交配，获得 flox 杂合同时带有 Cre （f/+；Cre+）的小鼠，再与flox 杂合子（f/+）交配，这样最终可以获得 1/8的 flox 纯合且带有 Cre 的条件性基因敲除小鼠（f/f；Cre+）。

是不是觉得1/8的比例太低了？那可以用下面的方法，轻轻松松将效率提高一倍。很简单，在繁育 f/+；Cre+ 的同时，繁育 flox 纯合子（f/f），再将这两种小鼠相互交配。这样，就可以获得 1/4 的 f/f；Cre+ 敲除小鼠啦。

来源：科研小白的进阶之路

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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