通过改变细胞外基质的粘弹性产生功能不同的T细胞群

过继性T细胞疗法的疗效在很大程度上取决于T细胞群的产生，这些T细胞群提供了快速的效应功能和长期的保护性免疫。然而，越来越清楚的是，T细胞的表型和功能与它们在组织中的定位有内在的联系。

基于此，哈佛大学David J. Mooney教授团队研究表明，通过改变周围细胞外基质(ECM)的粘弹性，接受相同刺激的T细胞可以产生功能不同的T细胞群。通过使用基于降冰片烯修饰的I型胶原的ECM模型，其粘弹性可以通过与四氮基团的生物正交点击反应改变共价交联的程度而独立于其体积刚度进行调节，我们发现ECM粘弹性通过激活因子-蛋白-1信号通路调节T细胞表型和功能，激活因子-蛋白-1信号通路是T细胞活化和命运的关键调节因子。我们的观察结果与从癌症或纤维化患者的机械不同组织中分离的T细胞的组织依赖性基因表达谱一致，并表明基质粘弹性可以在产生用于治疗应用的T细胞产品时加以利用。相关工作以“Generation of functionally distinct T-cell populations by altering the viscoelasticity of their extracellular matrix”发表在《Nature biomedical engineering》。

图1. 组织微环境影响T细胞表型

T细胞表型在体内不同的机械组织中是不同的

首先，为了证实和扩展先前关于组织微环境方面可能在体内调节T细胞表型的报道，分析了已发表的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集，比较了非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌和结直肠癌患者肿瘤、邻近正常组织和血液中的CD8+ T细胞，代表了不同的机械环境。这些分析是针对泛T细胞和组织类型之间具有共享TCR克隆型的T细胞进行的。选择这三种组织类型是因为它们跨越了非常柔软、快速放松和僵硬、缓慢放松组织之间的光谱。泛T细胞的均匀流形近似和投影(UMAP)图显示了来自不同组织区室的T细胞的不同定位，与血液相比，来自肿瘤和相应正常组织的T细胞之间的重叠增加(图1a)。通过对肿瘤来源的T细胞与正常组织和血液中的T细胞进行差异基因表达分析，为每种肿瘤类型生成肿瘤T细胞基因特征。然后将这些特征应用于来自不同组织区室的T细胞，比较它们的总表达水平。血液中的T细胞肿瘤T细胞基因特征表达最低，邻近正常组织中的T细胞表达居中(图1b)。当对具有共享TCR克隆型的T细胞进行相同的分析时，这种趋势保持不变(图1c)。这些结果表明，组织微环境可能在调节T细胞表型中起作用。

图2. 合成具有可调力学性能的胶原基ECM仿生材料

合成具有可调力学性能的胶原基ECM仿生材料

接下来，研究者设计了一个基于I型胶原蛋白的ECM模型，允许独立调整T细胞培养的基质刚度和粘弹性。I型胶原蛋白首先用降冰片烯(Nb)修饰，并通过逆电子需求Diels-Alder反应与四嗪(Tz)发生高度选择性的生物正交点击反应。通过改变胶原浓度来调节基质刚度，而在低分子量Tz交联剂的NB修饰胶原胶凝后加入局部共价交联可以调节基质的粘弹性，而不改变刚度(图2a)。研究者使用了两种胶原蛋白浓度，因为这些浓度产生的基质跨越了多个软肿瘤的刚度范围，以及恶性肿瘤前和恶性肿瘤。对基体的力学表征表明，虽然点击交联会影响基体的粘弹性，体现在基体的剪切应力松弛和损失角上，但不影响剪切体刚度值(图2b、c)。通过低温扫描电镜和二次谐波成像(SHG)进一步表征表明，点击交联既没有改变胶原基质的纤维结构或孔径分布(图2d、e)，也没有影响胶原纤维的长度、波纹度或纤维之间的角度。重要的是，对纳米压痕的局部力学性能分析证实，每种胶原浓度的储存模量(G’)相似，但快速松弛和慢松弛基质之间的损失模量(G’)显著不同。

图3. 细胞外基质粘弹性调节T细胞转录组谱

细胞外基质粘弹性调节T细胞的转录组谱

为了研究ECM粘弹性如何驱动T细胞转录景观的变化，接下来对在快松弛和慢松弛胶原基质中培养的CD8+ T细胞进行了scRNA测序。UMAP分析显示了两种T细胞群的不同定位(图3a)。与快速松弛基质相比，在慢松弛基质中，几种传统的活化和抑制性T细胞标志物，包括IL2RA (CD25)、ENTPD1 (CD39)(图3b)，以及FAS、TNFRSF4 (OX40)和LAG3上调。此外，与T细胞效应表型相关的转录因子如PRDM1 (BLIMP-1)和ZEB2在慢松弛基质中培养的T细胞中也表达得更高。值得注意的是，与AP-1通路相关的几个基因，包括JUN、ATF3、BATF(图3b)、FOS和FOSB，以及一些丝裂原激活的蛋白激酶，如MAPK8、MAPK6和MAPK1，在慢松弛基质中培养的T细胞中富集。相比之下，快速松弛基质中的T细胞表达更高水平的T细胞记忆标记物和记忆相关转录因子，如CD62L、KLF2、CXCR3和S1PR4(图3b)。

图4. 不同粘弹性的ECM产生的T细胞群具有不同的AP-1蛋白表达模式

基质粘弹性影响AP-1蛋白表达模式

接下来，研究者研究了AP-1蛋白的表达模式及其相互作用，特别是与c-Jun的相互作用，因为它们在T细胞表型和功能的调节中很重要。特别是，c-Jun和c-Fos是典型的AP-1伙伴，已被证明可以促进IL-2的产生。BATF促进效应T细胞分化，但也导致耗竭。JunB已被证明可以促进Th17分化和IL-2的产生，但也促进T细胞衰竭和效应Treg分化。流式细胞术分析显示，T细胞在快松弛和慢松弛基质中培养后，c-Jun、c-Fos和BATF的表达增强(图4a,b)。此外，通过细胞裂解物的c-Jun共免疫沉淀来评估AP-1结合伙伴，来自慢松弛基质的T细胞表现出c-Fos、JunB和BATF与c-Jun之间更高的相互作用(图4c)。

图5. ECM粘弹性不选择特定的T细胞克隆

ECM粘弹性不选择特定的T细胞克隆

为了评估基质粘弹性所带来的表型差异是否与特异性T细胞克隆的选择和持久性有关，我们使用来自不同供体的T细胞进行了scRNA测序和TCR测序。对不同条件下的pan T细胞进行UMAP分析显示，平板培养、快松弛和慢松弛基质条件下的T细胞定位不同(图5a)。从图3中先前的scRNA-seq生成的SModule应用于该数据集中的泛T细胞，以调查不同供体之间的一致性。SModule的表达趋势与图3一致，在慢松弛基质中培养的T细胞具有最高的SModule表达(图5b)。

【小结】

本研究的结果支持了体内组织定位对T细胞命运至关重要的报道，并确定组织粘弹性是一个重要的机械参数，可以调节T细胞的表型和功能。在这一原则的基础上，我们展示了通过调整ECM粘弹性产生功能不同的T细胞群。研究者希望这项研究能够激发T细胞制造方法的探索，将粘弹性作为产生特定治疗应用所需T细胞产品的参数。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01052-y

来源：BioMed科技

转自：“高分子科学前沿”微信公众号

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