阅读： 2022/6/20 10:31:47
之前我们分享了原代组织的准备和肿瘤类器官培养方案，《师弟求着问我要的类器官培养手册，看完直呼太香了！》，不少小伙伴已经摩拳擦掌跃跃欲试了。先别急，本期我们将继续带来下篇，提供肿瘤类器官的传代、冻存和复苏步骤，让你 360 度无死角掌握肿瘤类器官培养。本方案修改自：Driehuis E, et al. Nat Protoc. 2020[1]。
01? 类器官的传代
1）上下吹打以破碎基底膜提取物（Basement Membrane Extract ，BME），然后将类器官悬浮物转移至 15 mL 锥形管中。 2）为了促进 BME 的去除，从顶部加入 10 mL 冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基。 3）类器官在 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟。 吸出上清液，采用 TrypLE 或机械破碎来分解类器官，前者适用于头颈部和紧实的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官，后者适用于卵巢和囊性的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官。
? 在采用机械破碎时，将沉淀重悬在 3 mL adDMEM/F12+++ 培养基中。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，上下吹打类器官悬液 30 次。枪头紧靠管的底部来产生更大压力，有助于类器官的分解。 ? 在采用 TrypLE 解离细胞时，将沉淀重悬在 1 mL TrypLE 中，上下吹打并在 37°C 条件下孵育，直至类器官分解。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，每 3～5 分钟上下吹打 ≥ 10 次，以促进类器官的分解。密切监控消化过程，尽量缩短 TrypLE 的孵育时间。
如上步骤的更优替代方案：基质胶收获液分解法
整个步骤在冰上操作，吸掉培养基并轻轻用 10 倍体积的冷（2～8℃）PBS（96 孔板- 50 μL/孔、48 孔板- 250 μL/孔、24 孔板- 500 μL/孔）来清洗，注意不要吹破包埋了类器官的基质胶。吸去 PBS，加 10 倍体积（同 PBS 用量）的冷（2～8℃）收获液（推荐 R&D Systems?，货号：3700-100-01）到每个孔，在 2～8℃ 的冰上孵育 30～90 分钟并进行温和的振荡，直到基质胶完全消融，类器官漂浮起来。 如果要将类器官细胞团分解，请将溶液吸入无菌注射器，并装上 20 号针头，推动注射器（所使用的力量和速度决定推出的细胞团的大小）。 之后，在冰上将孔板内的含类器官的溶液转移到 15 mL 或 50 mL 的离心管中，在 2～8℃ 条件下以 500 g 的转速离心 5 分钟，去上清。用 10 倍体积的冷（2～8℃）PBS 再次清洗，在 2～8℃ 条件下以 500 g 的转速离心 5 分钟，收集类器官沉淀用于后续操作。 注 ● 使用 TrypLE 解离不要超过 15 分钟，因为这可能导致类器官生长不佳，甚至培养物损失。根据经验，在观察到小块细胞（由 2～10 个细胞组成）的混合物时，消化即已完成。 ● 如果在为药物筛选做准备，则不完全消化产生的大块细胞或完整的类器官碎片将导致类器官产量很低，因为在制备药物筛选的类器官悬液时这些过大的细胞和碎片都会被过滤掉。
5）在消化完成后，用 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基清洗。 6）按照《师弟求着问我要的类器官培养手册，看完直呼太香了！》第 8～11 步所述，将类器官沉淀重悬在 70%（体积比）BME 中，并以小液滴的形式铺在预热的培养板底部。在铺板完成后，翻转培养板并将其置于 37℃、5%（体积比）CO2 加湿培养箱中，孵育 30～60 分钟。 7）将含有 10 μM ROCK 抑制剂的类器官培养基预热至 37℃。 8）在 BME 微滴凝固后（30～60 分钟），向各孔中小心加入预热的培养基。 9）将培养板置于 37℃、5% CO2 加湿培养箱中，直到类器官要用于药物筛选。或者用于后续的冻存和复苏步骤。
