阅读： 2023/12/20 16:05:30
一、基本资料
CCK-8法是一种WST-8被细胞内脱氢酶还原显色的活细胞计数方法，广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖实验、细胞毒性实验以及药敏实验等。
二、原理
CCK-8的主要成分是水溶性四唑盐[Water Soluble Tetrazolium-8](2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐)，水溶性四唑盐是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（Formazan）。甲臜能够直接溶解在培养基中。活细胞数目越多，则颜色越深。对于同样的细胞，颜色的深浅与细胞数目呈线性关系。
CCK-8法有以下优点：
1. MTT法生成的甲臜不是水溶性的，需要DMSO等有机溶剂溶解；CCK-8产生的甲臜是水溶性的，省去了溶解步骤，减少实验误差。
2. CCK-8法适用于悬浮细胞的活性测定。
3. CCK-8法比MTT法的线性范围更宽，灵敏度更高。
4. CCK-8法对细胞无毒性，可多次测定。
5. CCK-8法适合大规模、高通量的样品检测。
三、主要步骤
校准分析
1. 取生长面积 75 cm2 的细胞培养瓶，在细胞指数期将上清液培养基转移到无菌的 50 ml 锥形离心管（Falcon管）中，保存备用。
2. 用 10 ml PBS溶液洗涤细胞层，弃去PBS溶液。
3. 加入 3 ml 细胞消化液，等待细胞分离。
4. 用步骤1的培养基重悬细胞，并将细胞悬浮液转移到无菌的 50 ml 锥形离心管中。
5. 用 180 xG 离心 00:08:00 沉淀细胞，弃去上清液，并加入 10 ml 新鲜培养基，弃去旧培养基和细胞消化液。
6. 重悬细胞并取 200 μl 充分混合的细胞悬浮液样品。
7. 将 100 μl 细胞培养样品与 100 μl 0.4％台盼蓝溶液混合。
0.4%台盼蓝溶液：将 4 g 台盼蓝溶液 1000 ml 0.9%NaCl溶液中，过滤0.2 μm孔径以去除未溶解的台盼蓝晶体。
8. 重新悬浮后，将血细胞计数器的两个腔室各填充 10 μl 样品。
9. 计算血细胞计数器的八个角落方格中每一个的细胞总数（台盼蓝染色和未被染色）。
10. 通过仅对染色细胞进行计数来计算细胞培养物的活力，使用以下公式中的该值。
11. 用培养基进行细胞悬浮液的等距连续稀释（例如，原始细胞密度的100％、80％、60％、40％、20％和0％）。
12. 移取96孔板中的细胞，对于贴壁细胞，使其在恒定条件下粘附约 04:00:00 。
13. 继续进行所需的活力测定方案。
14. 在每个稀释步骤的培养时间内绘制吸光度/荧光信号，以确定每种特定细胞系或不同条件下测定的线性范围和可能的最大吸光度。
WST-8测定
1. 从细胞中移除培养基，并用WST-Medium Mastermix替换。始终确保设置无细胞的空白对照，以确定非特异性的甲臜转化。
避免形成气泡，因为它会严重干扰吸收测量。
2. 孵育细胞 01:00:00 - 04:00:00 h。
3. 测量WST信号在 450 nm 处的吸光度。建议在 650 nm 处进行第二次测量，以评估气泡、细胞的光散射或盖子上的冷凝水等影响因素。在测量之前，将板摇动 00:00:10 ，使形成的甲臜均匀分布在整个孔内。
4. 绘制 450 nm 处的吸光度信号与细胞数的关系图，用于对细胞浓度校准。使用先前完成校准的吸光度信号计算细胞密度，以创建生长曲线。以％计算样品和对照培养物的信号强度比，以确定细胞毒性。
5. 如果需要细胞进行进一步的实验，则移除含WST的溶液，加入 100 μl 新鲜的培养条件培养基。
四、实验解疑
1. 一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
2. 能否用384孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3. 能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4. 酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5. CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6. CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7. CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8. 如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450 nm到490 nm之间的滤光片。
9. 如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10. CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定？
11. CCK-8能否对活细胞进行染色？
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
12. CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。
13. 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
14. 每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2. 有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
15. 如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
16. 哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
17. 在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
18. 设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
19. 说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
20. 在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
有以下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
21. 必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
22. 如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
23. CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
文章来源于中北科研
转自：“博舜科研”微信公众号
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