从1918年西班牙大流感事件到2019年新冠肺炎爆发的一个世纪以来，世界上平均每十几年爆发一次新发传染性疾病（如所熟知的西班牙流感，埃博拉病毒，艾滋病毒，禽流感、寨卡病毒、非洲猪瘟、SARS、及新冠病毒等），因此开发快速核酸检测技术用于当前或将来的传染性疾病防控是世界范围内的重要科学课题。

受新冠疫情的推动，目前国外对居家（基层）核酸检测技术的研发在如火如荼的开展，如美国 Detect 公司开发的 DetectTM COVID-19 Test，美国 Lucira Health 公司开发的 LuciraTM Check it COVID-19 Test Kit，美国雅培公司开发的 ABBOTT COVID-19 Test 等已经获批开始销售。而在国内，居家（基层）核酸检测技术尚处于发展阶段，目前尚无成熟的商业化产品问世，因此加速开发新一代居家（基层）核酸检测技术具有重要社会效益和经济价值。

CRISPR 技术的问世掀起了生物技术领域的革命。因其高灵敏度、高特异性、以及反应温度温和等优点，近来 CRISPR 技术已经被广泛应用于分子诊断领域。2018年，Science 杂志把 CRISPR 诊断技术誉为“下一代分子诊断”技术，而 Nature 杂志也把CRISPR 诊断技术也列为2022年最值得关注的7项技术之一。

将 CRISPR 检测和核酸等温扩增技术结合起来，可以实现在单个温度下对核酸进行扩增和检测，这一特性对于发展简易的核酸检测方法和仪器具有重要的价值。作为一项虽然先进但又很年轻的诊断技术，CRISPR 诊断目前还存在转化应用的关键瓶颈亟待突破。特别是，因为核酸等温扩增和 CRISPR 切割体系不兼容，目前 CRISPR 诊断技术的主流方法是将核酸扩增过程和 CRISPR 检测过程分步进行。但是分步反应需要反应试管的开盖和液体转移，从而增加检测步骤的复杂性、检测设备构建的难度和成本。此外，液体转移步骤非常容易引起气溶胶污染，从而导致假阳性。因此，核酸等温扩增和 CRISPR 检测的兼容性问题是商业化应用的一个关键障碍。

近来，华南师范大学生命科学学院周小明课题组在国家自然科学基金委原创探索项目、基金委重大研究计划、湖北省重点研发计划等课题支持下，在解决这一问题上取得了关键突破，提出了两种解决方案。

该团队发明了一种甘油添加剂增强的单管 CRISPR 核酸检测方法。该研究于2022年5月30日发表于 Analytical Chemistry 期刊，论文题为：Glycerol Additive Boosts 100-fold Sensitivity Enhancement for One-Pot RPA-CRISPR/Cas12a Assay。

利用甘油粘稠的特性，通过延迟单管反应中等温扩增与 CRISPR 体系的融合，缓解了单管反应中 CRISPR 体系对等温扩增模板核酸的切割，显著地提高了单管核酸检测的效率（100倍）。

该团队还发明了一种光控 CRISPR 检测技术。该研究于2022年6月21日发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）上，论文题为：Photocontrolled crRNA activation enables robust CRISPR-Cas12a diagnostics。

在光控的CRISPR检测中，通过设计沉默核苷酸与引导 RNA 互补，从而阻断 CRISPR 体系的识别切割功能。同时，该沉默核苷酸链由可被紫外光断裂的连接子偶联。当将这种失活的 CRISPR 检测体系与核酸等温扩增技术结合到一管内反应时，核酸模板不会被 CRISPR 所切割，所以扩增效率不受影响。当核酸扩增完成以后，用光激活 CRISPR 启动检测过程。光控 CRISPR 方法将核酸扩增和 CRISPR 检测在时间维度上分开，实现了封闭的，无需开盖转移试剂的，高灵敏度核酸检测。

上述工作由周小明研究员指导博士生林梅、胡梦露，硕士生邱志强等完成。该技术在新冠临床样本测试上得到了湖北省疾控江永忠所长的大力帮助。该工作目前已完成国家发明专利和PCT专利申报和原型机的开发。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00616

https://doi.org/10.1073/pnas.2202034119

转自：生物世界

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