叶酸是一碳转移反应中关键的辅助因子，对于核酸的合成不可或缺1。哺乳动物由于缺乏叶酸从头合成途径，依赖于从食物中摄取叶酸2。对人类而言，还原型叶酸载体蛋白 (human reduced folate carrier, hRFC) 在细胞对叶酸的摄取中发挥主要的作用， hRFC也是化疗药甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX) 主要的作用靶点3，编码RFC的基因突变会导致对叶酸拮抗剂耐药性的发生。

hRFC又称SLC19A1，属于SLC19家族，为有机阴离子转运体4,5，主要通过转运硫胺素单磷酸 (thiamine monophosphate, TMP) 或硫胺素焦磷酸 (thiamine pyrophosphate, TPP) 驱动还原型叶酸和叶酸拮抗剂的反向转运6。相比于叶酸和其他阴离子化合物，RFC对还原型叶酸和叶酸拮抗剂具有明显的偏好性，除此之外，hRFC对其他一系列的有机或无机阴离子都具备一定的转运能力。虽然对RFC的研究可追溯至上世纪60年代，但其转运叶酸或叶酸拮抗剂的分子机制仍不清楚。

2022年9月7日，来自杜克大学的Seok-Yong Lee团队在Nature上在线发表了题为Methotrexate recognition by the human reduced folate carrier SLC19A1的科研论文。文章揭示了hRFC无底物结合以及结合MTX的冷冻电镜结构。在此基础上，研究人员结合分子动力学模拟和一系列功能验证，提出了hRFC选择性转运叶酸和叶酸拮抗剂的分子机制，并对其阴离子选择性做出了解释。

hRFC缺乏可见的胞外结构域，且分子量仅有60 kDa，给结构解析带来了极大的困难。通过在TM6与TM7之间融合Bril28，作者解析得到了hRFC无底物结合状态3.6 ?的结构以及结合MTX 3.8 ?的结构，但在结合MTX的结构中，并未明显观察到相应的信号。

由于蛋白纯化条件或小分子本身结合特性的影响，MTX在hRFC中的结合可能是动态的。为了进一步稳定MTX，研究者利用偶联了N-羟基丁二酰亚胺的MTX (NHS-MTX) 对hRFC的K411进行共价修饰，最终解析得到hRFC结合MTX 3.3 ?的结构，且配体结合的位置能够确定 (图1)。hRFC为经典的MFS fold，本文最终得到的3个结构均呈向内开口构象。hRFC的TM1、TM4和TM7不连续，共同围绕形成中央腔隙，腔隙中容纳有MTX。

图1. hRFC结合MTX的密度图

hRFC的中央腔隙高度保守，含有电性相对的两个区域。靠近胞内的一侧为正电环 (electropositive ring)，含R42、R133、R373和K411。另一侧为负电口袋 (electronegative pocket), 含E45、E123和D310。在非洲爪蟾卵母细胞中对氨基酸残基的功能进行验证，发现这些氨基酸残基的突变会导致hRFC对MTX的摄取能力下降，提示hRFC中央腔隙中的化学环境对蛋白功能有重要的影响。

图2. hRFC的中央腔隙可以分为电性相对的两个区域

MTX整体分为3部分：蝶啶环、对氨基苯甲酸酯 (p-aminobenzoate, PABA) 和L-Glu。在正电环内，L-Glu的α-carboxylate与TM4上的R133相互作用，对比无底物结合与结合MTX的结构，可发现存在以R133为中心的轻微构象变化。在负电口袋附近，PABA周围存在Y126、M130和Y286。负电口袋内的蝶啶环与TM1上的氨基酸残基存在密切的相互作用，其中E123尤其重要。在功能试验中，这些氨基酸残基的突变，在很大程度上影响了RFC对MTX的摄取 (图3)。

图3. MTX与周围氨基酸残基的相互作用以及各种叶酸拮抗剂的结构

通过对hRFC的一系列底物进行结构上的比对，研究人员发现这些底物的主要差异在它们的杂环部分。如在MTX中，杂环为蝶啶环，而在培美曲塞 (pemetrexed, PMX) 的相应位置，蝶啶环被吡咯并嘧啶环所取代 (图3)。结合结构分析，研究人员认为I48与E123可能在hRFC对还原型叶酸和叶酸拮抗剂的选择性中发挥重要的作用，在冷竞争试验中，I48F会改变hRFC对底物的选择。

在之后的全原子分子动力学模拟中，研究者发现，当MTX与hRFC以共价键结合时，MTX在中央腔隙中的维持保持恒定，而当二者之间的共价键去除后，虽然蝶啶环在负电口袋中仍保持相对固定，但L-Glu在正电环内高度动态，与3个保守的精氨酸残基 (R133、R157和R373，后称精氨酸三联体) 相互作用，R133在L-Glu的稳定中起关键作用。

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在KCl存在情况下，对不结合MTX的hRFC进行模拟，发现在R133和R373之间氯化物的概率密度最高，R157附近的密度相比之下更为分散。通过引入K411Q、R373K和K393M改变电性，可使K+结合在负电口袋中。结合结构、分子动力学模拟和功能试验数据，研究人员提出了hRFC转运阴离子和MTX的可能机制 (图4)：当细胞膜外表面带正电时，hRFC易于在向外开口的构象下结合阴离子。在蛋白从向外开口转变为向内开口时，精氨酸三联体稳定了底物的结合，而高度动态的R157可能在阴离子交换中发挥更重要的作用。

图4. hRFC阴离子交换和转运和模型

此外，通过比对本文结合MTX的hRFC结构与结合PMX的质子偶联叶酸转运体 (proton-coupled folate transporter, PCFT) 结构，作者提出了优化药物优化的方向。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05168-0

转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号

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