以下文章来源于青椒医学 ，作者青椒哥

粉丝问：我有个B蛋白调控C通路，已经做了显著的功能结果，该如何选择上游调控分子A呢？

A该怎么寻找啊？

这个问题非常典型，也是大部分科研工作者面临的最常见的困惑。

这一A-B调控轴的寻找对于下一步实验，以及国自然科学假说的搭建至关重要，那么我们来进行详细的逻辑阐述，一共分为3步：

（一）第一步：分子B表达差异的调控层次确定

（二）第二步：分子B的具体调控机制（mechanism）的确定

（三）第三步：基因B机制调控的工具分子A（molecule）的确定

今天，我们先来讲讲第一步

第一步：分子B表达差异的调控层次确定

对于医学科研来讲，我们通常希望筛选到疾病发生前后表达有差异的分子（Differentially Expressed Gene，DEG），作为研究对象，如下：

表达差异是筛选功能分子常见逻辑

那么我们自己的课题的明星分子B，一般来自于测序数据的分析，要么蛋白质组测序数据，要么就是转录本的测序或者芯片数据。

1.我们会根据不同来源数据的火山图、热图、表达倍数（fold change）、PPI网络分析、功能富集分析等结果，锁定4-6个潜在功能分子。

2.通过IHC，WB，qPCR，跟进一步通过动物实验和细胞实验，确定B分子的功能和具体的作用信号通路C。

那么我们所说的调控层次指的是什么？很重要吗？

这就不得不说中心法则“DNA转录→pre-mRNA可变剪接→不同转录本mRNA→蛋白质→蛋白质翻译后修饰”的生物学过程。而pre-mRNA可变剪接决定了mRNA的丰度。

既然是“表达差异”，那么在整个调控轴的哪个环节，出现了首次表达差异呢？这个是比较关键的判断标准，因为这个是分子丰度差异的源头。

因此需要设计实验针对B蛋白的pre-mRNA、mRNA、蛋白质的水平进行表达水平定量确定。

这时候，我们通常会见到SCI文章中经常出现的转录抑制剂Azathramycin D、蛋白合成抑制剂Cycloheximide (CHX)。

转录本稳定性研究

蛋白稳定性研究

然后用qPCR判断pre-mRNA水平变化，来确定是否调控发生在转录水平；用qPCR检测mRNA，来判断调控是否发生在可变剪接水平；用WB检测判断B分子是否发生在蛋白翻译后修饰水平。

知道了分子B表达差异的发生场所，这样你才能够进一步判断具体的调控机制。

后续两期，请期待

（二）第二步：分子B的调控机制的确定

（三）第三步：基因B机制调控的工具分子A的确定

转自：“学术查”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！