常常听到萌新师妹抱怨，细胞冻存得好好的，后面想用时怎么就用不了呢？

实际上，细胞冻存的重要性不亚于细胞培养。丁香实验在此对细胞冻存的原理及方法步骤进行梳理，希望能够帮助到为细胞冻存实验「头秃」的科研人。

一、细胞冻存的原理

传统的细胞冻存（甘油/二甲基亚砜作为保护剂）实验讲求的要点是：慢冻速溶。

细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜（DMSO），这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

当细胞生长至对数中晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻，后转移至液氮环境中长期保存。

二、细胞冻存的步骤

1. 预先配制冻存液：按正常培养基：DMSO =9:1比列配制冻存液；

2. 取对数生长期细胞，用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，离心转速为1000 rpm，离心时间为5 min；

3. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量提前配制好的细胞冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/mL～1×107/mL；

4. 将细胞分装入冻存管中，每管体积约为1～1.5 ml；

5. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间、细胞代数及操作者的名字，以便于后续溯源信息；

6. 提前往冻存盒中加入异丙醇（在负八十冰箱中能以1℃/min的速度下降），随后放入-80℃的低温冰箱即可，建议冻存时间为12小时以上。冻存完成的细胞一般能够在-80℃冰箱中保存半年至一年，长期保存要转移至液氮中，商用冻存液可以直接将冻存管放置于-80℃冰箱中。

三、细胞冻存经典问答汇总

如果还是没有十足的把握，也可以先从前辈们的实验经验中总结实验要点，提前避「坑」！

?关于细胞冻存 DMSO 浓度

?有关细胞冻存后 - 80℃保存的问题

?细胞冻存液污染了，细胞怎么办？

?细胞冻存传代多久一次比较适合?

?细胞冻存使用培养液可不可以？

?细胞冻存一定要加血清吗？

看完上述细胞冻存的实验原理及方法步骤，科研小白们心里是否有底了呢？细胞冻存是细胞实验的关键步骤，因此一定不能大意，要常练习、多总结。

转自：“生物学霸”微信公众号

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