常有新手小白在实验哀嚎，小鼠肝细胞培养实验怎么这样难：肝细胞要么贴壁不牢，要么突然被污染，比我的「玻璃心」还要脆弱！

培养细胞细节繁琐，失败率较高，每步操作都马虎不得。因此，掌握实验的原理和步骤，注意实验技巧显得尤为重要。

一、实验原理

实验者直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代细胞培养。

原代培养是建立各种细胞系的关键第一步，是从事培养工作的科研人员应熟悉和掌握的最基本的技术。因此，根据培养方法不同分为组织块培养法和消化培养法。

??? 组织块培养法 protocol

??? 消化培养法 protocol

二、实验材料与仪器

小鼠、DMEM、胰酶、PBS、饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管、6 孔培养板、吸管、移液管、手套和微量加样器。

三、实验步骤

1. 将小鼠断颈处死，置于 75% 酒精泡 2~3 秒钟消毒，取肝脏，置于盛有 PBS 的平皿中。

2. 剔除小鼠的脂肪、结缔组织和血液等杂物，将其转移到另一个盛有 PBS 液的平皿中。

3. 用手术剪将脏器剪成小块 (大小约 1 mm2)，玻片研磨后将其转移到离心管，离心 1000 rpm，离心 5 min。

4. 根据小鼠组织或细胞量，加入 5~6 倍 (约 3~5 ml)的胰酶。在 37℃ 水浴锅中消化 20 分钟后，每隔 5 分钟轻轻地振荡一次，或用吸管吹打一次，促使细胞分离。

5. 加入 3~5 ml 含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用 100 目孔径滤网滤过培养液，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心培养液 5 min，弃去上清液。

8. 加入无血清培养液 5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液 1~2 ml (视细胞量加入)，血球计数板计数。

10. 将细胞调整到 5x105/ml 左右，转移至 6 孔培养板中，37℃ 下培养。

四、注意事项

1. 处理小鼠肝组织时，全程进行无菌操作，防止引入污染。

2. 控制胰酶消化时间，防止过度消化。

3. 选择合适的滤网过滤，以除去组织块。

4. 在 37℃ 培养箱中培养肝细胞，及时观察细胞状态，根据实际情况进行调整和处理。

转自：“丁香学术”微信公众号

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