近年的研究表明，环形RNA（circRNA）在真核生物体内具有广泛的生物学功能。由于环形RNA序列与线性RNA相似度高，因此如何高效鉴定环形RNA特有的外显子结构，是环形RNA研究中的重要问题。

近日，中国科学院北京生命科学研究院赵方庆团队在 Nature 子刊 Nature Protocols 上发表了题为：Full-length circular RNA profiling by nanopore sequencing with CIRI-long 的研究论文，建立了环形RNA全长转录本解析和高效挖掘的技术体系。

赵方庆团队前期提出了CIRI-AS算法（基于BSJ读段对比结果对环形RNA内部可变剪接结构进行识别）。后续研究开发了CIRI-full算法（通过识别双端250bp测序数据中反向重叠区特征，对500bp以内的环形RNA进行全长重构）。上述方法主要基于短读长测序技术，难以对长度500bp以上的环形RNA的全长序列进行有效识别。在此基础上，赵方庆团队开发了基于纳米孔测序的环形RNA全长测定方法——CIRI-long，实现了对不同长度环形RNA全长结构的高效鉴定（Nature Biotechnology, 2021）。

在这项最新研究中，赵方庆团队利用小鼠脑组织及人HeLa细胞系样本作为示例，阐释了环形RNA高效富集与全长测定方法：利用核糖体RNA去除试剂盒与改进的RNase R处理流程，消化RNA样本中的核糖体RNA与其余线性RNA分子，对环形RNA进行初步富集；利用随机引物逆转录与PCR扩增，构建cDNA文库。

在该过程中，环形RNA模板可以发生滚环逆转录，产生含有多个环形RNA全长序列的嵌合体cDNA，而来自线性RNA的cDNA产物长度较短。因此，后续流程中使用了片段筛选策略，对环形RNA来源的cDNA片段进行了进一步富集，从而有效提升了文库中环形RNA来源片段所占比例。利用长读长纳米孔测序技术进行cDNA分子的全长测定，并使用该团队开发的CIRI-long算法，对测序数据中的环形RNA序列进行识别与错误校正，从而获得高置信度的环形RNA全长结构。

前期研究观察到使用具有模板切换活性的逆转录酶，可以在滚环逆转录产生的cDNA末端直接引入PCR引物序列，从而实现对低起始量环形RNA的高效捕获（图1）。然而，该活性依赖5' RNA线性末端参与，因此不含5'与3'线性末端的环形RNA如何发生模板切换的原理尚未明确。

该工作进一步利用体外转录构建的模式环形RNA对滚环逆转录过程进行了进一步探究发现，经过逆转录后，大部分环形RNA模板发生了水解，从而提供了模板切换所需的线性5'末端。同时，在不加入逆转录酶的对照组中，环形RNA均保持了完整的环状结构。该成果提示环形RNA滚环反转录中的模板切换主要依赖RNA模板的线性化水解，为CIRI-long流程提供了重要的理论支持。

同时，该研究总结了CIRI-long方法的应用，提出了CIRI-long方法可以为新型环形RNA如线粒体来源环形RNA或内含子自连型环形RNA的存在提供有力的支持证据。同时，重构获得的环形RNA全长序列可用于后续环形RNA的功能预测（如miRNA或RBP结合位点分析）。此外，利用长读长测序方法构建出的环形RNA序列，可作为评估基于传统二代测序技术的环形RNA拼接算法的标准数据集，为现有算法的改进提供指导方向。

与近年开发的多个长读长环形RNA测序技术相比，CIRI-long方法实验步骤更为便捷，同时可以实现对不同长度环形RNA全长结构的直接测定，可应用于多种组织与细胞样本，颇具应用前景。

转自：“生物世界”微信公众号

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