CRISPR-Cas 基因编辑在基础研究和临床实践上有重大的应用潜力，已经成为了当前生物医药研究中的热点。目前广泛使用的 Cas9 和 Cas12a 基因编辑系统存在分子量大、递送困难、编辑位点有限、易于脱靶等缺陷。同时，这些基因编辑系统的底层专利均归属于欧美国家。自然界中存在着种类丰富的 CRISPR-Cas 系统，但其中被挖掘和表征的系统只是其中的冰山一角。研究和开发具有独特性质的新颖 CRISPR-Cas 编辑系统，对于推测 CRISPR-Cas 的演化机制，丰富 CRISPR-Cas 基因编辑工具库，推动 CRISPR-Cas 的应用和获得具有自主知识产权的基因编辑系统都具有重要意义。

2023 年 7 月 3 日，上海科技大学季泉江课题组在 Molecular Cell 上发表了文章 Cas12n, early evolutionary intermediate nucleases of type V CRISPR, comprise a distinct family of miniature genome editors，成功开发了一类能在细菌和人类细胞中进行高效基因组编辑的新颖微型 CRISPR-Cas12n 系统。

CRISPR-Cas12n 是一类 V-U4 型 CRISPR-Cas 系统，与 V 型 CRISPR 系统的祖先——转座相关核酸酶 TnpB 具有最近的亲缘关系，可能是 TnpB 演化为其它 V 型 Cas 核酸酶的最早进化中间体（图 1）。目前尚没有对该类 CRISPR-Cas 系统的性质和功能的研究报道。

图 1. Cas12n 系统的进化分析

研究人员对 CRISPR-Cas12n 进行了系统表征并发现 CRISPR-Cas12n 是一类微型基因编辑系统（仅含 400-700 个氨基酸），识别罕见的 AAN PAM 序列， tracrRNA 位于 Cas12n mRNA 内部，对被靶 DNA 序列产生两次切割，效应复合体中 Cas12n 核酸酶可能为单体分子。这些特征均与 TnpB 较为相似，这进一步证明了 Cas12n 与 TnpB 两者之间的亲缘性。与同为 V 型 CRISPR 系统的 Cas12a 和 Cas12f 相比，Cas12n 系统在 PAM 识别序列、tracrRNA 所在位置以及效应复合物结构特征方面均存在显著差异（图 2）。

图 2. Cas12n 与 TnpB、Cas12f 以及 Cas12a 的生化特征比较

在筛选了多种不同来源的 CRISPR-Cas12n 系统后，研究人员发现其中一种来源于海洋放线菌 Actinomadura craniellae 的 Cas12n 核酸酶（AcCas12n）具有较高的基因编辑活性。研究人员对 AcCas12n 系统进行了相关表征，发现 AcCas12n 能够高效地切割 DNA 双链，产生黏性末端，并进一步确定了切口特征。

此外，研究人员系统性地探索了 AcCas12n 对反应温度、盐离子浓度、二价金属离子种类以及靶向序列长度的选择性，获得了最适宜的反应条件。该系统能够在活细胞中进行高效基因组编辑，在细菌中的编辑效率接近 100%，而在人体细胞中的编辑效率，最高接近 80%（图 3）。

图 3. AcCas12n 系统在细菌和人体细胞中的基因编辑

研究人员还对 AcCas12n 系统进行了进一步优化，通过对引导 RNA (sgRNA) 的优化改造，得到了优化版本 Cas12Pro，进一步提升了该系统的编辑效率。此外，研究人员对 Cas12Pro 进行了全面的表征，包括在人体细胞中多个不同位点的编辑效率检测、使用腺相关病毒（AAV）载体在人体细胞中进行基因编辑、使用 Guid-seq 检测细胞全基因组水平的脱靶效应等。同时研究人员将 Cas12Pro 系统与目前最常用的 Cas9 和 Cas12a 系统进行比较。实验结果发现，Cas12Pro 系统在大多数位点的编辑效率接近 Cas9 和 Cas12a 系统（图 4），表明该系统在基因编辑领域具有重要的应用潜力。

图 4. Cas12Pro 系统与 Cas9 以及 Cas12a 系统的基因编辑效率比较

CRISPR-Cas12n 家族核酸酶是我国自主研发的新颖微型基因组编辑系统，拥有该家族系统的自主知识产权及底层专利。上海科技大学季泉江课题组前副研究员陈未中和博士研究生马佳诚为该论文的共同第一作者。季泉江教授为通讯作者。上海科技大学为第一完成单位。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.06.014

转自：“丁香学术”微信公众号

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