MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）和CCK8（细胞计数检测试剂盒）是常用的细胞增殖检测方法。它们都可以间接评估细胞数量，但具有一些区别。

MTT法

1. 检测原理

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

2. 局限性

由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

3. MTT检测法注意事项

① MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。

② MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，采用1mL/管（5mg/mL）小剂量分装，保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

③ MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。如有气泡，需用1mL针头将气泡挑破；

④ 配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

CCK-8法

1. 检测原理

CCK-8检测实际是基于CCK-8试剂盒的细胞检测方法。原理和WTT相似，都是由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，不同之处在于CCK-8法生成的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）是水溶的。故较MTT法减少了吸出培养液在加入有机溶剂溶解这一步，也算是MTT法的优化。

相对与MTT,CCK8试剂盒使用方便，即开即用；减少了实验过程重复性；减小了对细胞的毒性。另一方面，较于MTT法实验经费也会贵不少。

2. CCK-8法注意事项

① CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

② 使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

③ 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

④ 加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

⑤ 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

⑥ 本产品可以检测，但不能检测酵母细胞。向100μL培养液中加入10μLCCK-8溶液，并培养1-4小时或过夜。

⑦ CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加(注:活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。

⑧ 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。

⑨ 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。

MTT和CCK-8对比

MTT和CCK8区别主要体现在以下几个方面：

1. 原理不同：

Mtt实验基于细胞内还原酶活性的检测，而CCK8实验基于细胞内活性代谢产生的水溶性四唑酮盐的还原反应。

2. 应用场景不同

Mtt实验适用于各种类型的细胞，包括悬浮细胞和贴壁细胞，适用于细胞增殖和细胞毒性等方面的研究；而CCK8实验适用于细胞增殖和毒性检测、药物筛选、细胞治疗等方面的应用。

3. 操作方法不同

Mmt实验需要将MTT试剂加入培养皿内的细胞培养物中，处理时间较长，需要进行还原和洗涤步骤；而CCK8实验则可以在细胞培养基中直接加入试剂，处理时间短，操作简便。

4. 试剂稳定性不同

CCK8试剂比MTT试剂更加稳定，容易保存和使用，且对细胞的影响更小。

综上所述，Mtt实验和CCK8实验都是常用的细胞增殖和活性检测方法，它们的选择应根据实验目的和细胞类型进行合理的选择。

本文转自晶莱生物

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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