以下文章来源于MEPGT ，作者Yang

兰州大学刘建全团队揭示青藏高原茄科植物两类莨菪碱生物合成途径的演化历史

Yang, J., Wu, Y., Zhang, P. et al. Multiple independent losses of the biosynthetic pathway for two tropane alkaloids in the Solanaceae family. Nat Commun 14, 8457 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-44246-3

青藏高原地形复杂、气候多变、环境多样，是研究生物起源、多样化和生态适应的“天然实验室”。在这片充满神秘气息的雪域高原上，生长着一种神奇的藏药——山莨菪 (Anisodus tanguticus)（图1a），藏药名“唐冲纳布” [1]。根据传统的藏医学，该物种包含丰富的莨菪碱、山莨菪碱、阿托品等托品烷类生物碱[2]，广泛用于哮喘、中毒、眩晕、医学麻醉和一些炎症的治疗[3]。高原牧民会将山莨菪的茎叶拌在饲料中用于治疗牦牛腹胀、停食等病症，是治疗牦牛多种疾病重要的畜牧药之一。山莨菪提取物山莨菪碱编号为654，天然山莨菪碱编号为654-1、人工合成为654-2，其使用范围更为广泛，在国外一度被认为是“中国神药”。上世纪90年代，赴美工作的中国医生将山莨菪碱应用到重度头外伤的治疗中，从而大大缩短患者痊愈时间。山莨菪碱等托品类生物碱也存在于另外一种青藏高原的另一类青藏高原的高山植物-茄参属等植物中（图1）。

蒙汗药，在中国古典武侠小说中被经常提及。书中描述的蒙汗药多为粉末状，下在酒里，酒色略显浑黄。其实蒙汗药就是曼陀罗 (Brugmansia arborea)（图1），俗称“天使的号角”、“恶魔的果实”，是茄科曼陀罗属植物。其和山莨菪、茄参等植物一样，也含有莨菪碱、东莨菪碱和少量阿托品等生物碱[4]；主要成分仍然是莨菪碱等阿托品类生物碱。对于曼陀罗的药用最早可以追溯到三国时期，华佗制备“麻沸散”用于手术前麻醉[5]。

图1 | 山莨菪和木本曼陀罗植物形态图: a 山莨菪。b 木本曼陀罗。c 茄参。

关于这些传奇“神药”的研究历经一个多世纪，其主要成分是托品烷类生物碱莨菪碱和东莨菪碱。截止目前，该生物合成途径已经利用低海拔植物颠茄做为模式，进行了相对完整的研究[6]。然而尚不清楚的是：这类生物碱在不同的茄科植物中是如何起源的？为何只出现在少数的茄科类群中？为了解答这些问题，本研究对茄科中产生莨菪碱和东莨菪碱的三个属族的三个代表性物种：山莨菪 (A. tanguticus)、木本曼陀罗 (B. arborea)、茄参 (Mandragora caulescens) 和一个不产生该两种生物碱茄科一个近缘族的物种：枸杞 (Lycium chinense) ，进行了首次的组装和注释，并结合所有茄科植物高质量基因，对两类生物碱合成基因、位置进行了详细比较和确定。通过对基因组演化过程中经历多倍化历史事件的推演得知，山莨菪和茄参与其他茄科物种相比，除了共享茄科所经历的基因组三倍化 (WGT) 基因组加倍事件外，又经历了各自特有的全基因组加倍 (WGD) 事件（图2）。

图2 | 12个物种的系统发育关系及分化时间估算。a 旁系同源基因核苷酸同义替换率 ( ) 的分布。b 12个物种系统发育关系。节点旁边的黑色数值表示该特定节点的估计分化时间 (MYA，百万年前)。基因家族扩张和收缩事件数目( ) 分别用红色和蓝色表示。

通过对山莨菪、木本曼陀罗和茄参物种莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径基因序列相似性比较和表达模式分析，结果显示尽管三个物种亲缘关系较远，但仍然共用相同的生物合成途径合成莨菪碱和东莨菪碱（图3）。本研究首次对高原植物莨菪建立了病毒诱导基因沉默技术(VIGS)，也从该生物合成途径中选择了四个关键基因，包括TR、LS、HDH和H6H，利用VIGS技术在山莨菪中对每个基因进行了功能验证。

图3 | 莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径和TRI、CYP82M3基因的微共线性分析。a 莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径概述和分别来自山莨菪 (缩写为 Ata)、木本曼陀罗 (Bar) 和茄参 (Mca) 的候选基因表达谱热图。b 左图：依据直系同源基因推断出的茄科15个物种的系统发育树。右图：15个茄科物种和2个旋花科物种CYP82M3和TRI基因的微共线性分析。

图4 | LS和CYP80F1基因微共线性分析。a 15个茄科物种和2个旋花科物种LS基因的微共线性分析。b长筒蓝悬铃果物种LS残基的位置。c LS 和CYP80F1基因参与的海螺碱和莨菪醛的生物合成途径。d CYP80F1基因在5个物种之间的共线性分析。

祖先遗传途径的丢失可以通过在缺乏该性状的相关近缘物种中关键基因是否保留相对应的共线性区块来辨别[7-8]。通过15个茄科各族代表物种基因组微共线性分析显示，两种生物碱合成通路在大多数茄科物种中保留了保守的共线性区块和共线基因。这些高度保守的共线性区块以及基因树和物种树高度相似的拓扑结构共同表明，莨菪碱和东莨菪碱合成途径可能出现在所有茄科谱系的共同祖先中，但在后面各族的分化与多样化过程中，两个生物碱合成通路下游基因在大多数族中假基因化或丢失，从而导致它们只在茄科少数亲缘关系较远的族中存在（图3、图4、图5）。

图5 | 茄科系统发育和莨菪碱、东莨菪碱相关基因的共线性。

接下来，关键基因的功能验证结果表明，茄参TRI基因表现出底物高亲和力和高催化活性，是目前茄科已报道物种中实现该功能最强的基因，为未来莨菪碱和东莨菪碱的生物代谢工程提供了有效候选基因或遗传突变位点资源。通过分别在TRI基因关键位点引入功能缺失和功能获得性突变实验，我们确认了木本曼陀罗和土豆这两种类型物种中分别涉及TRI关键基因的功能减少/丢失和重新激活产生托品的生化能力（图6）。这些发现再次验证了莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径自其起源于祖先谱系以来独立和重复的多次丢失。另外，这些获得性突变实验的成功以及土豆中保留的两个生物碱合成通路基因的共线性区块，为未来在诸如土豆这样的茄科作物中建立一条预期有效的莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径提供了可能性：通过基因编辑这些失活基因以及转入丢失基因，预期可重新在这些作物中建立两种生物碱的生物合成通路。

图6 | 鉴定了合成两种生物碱物种的TRI基因、TRI突变体和LS基因的酶活性。a 5个物种TRI基因序列比较。b 木本曼陀罗TRI蛋白三维结构图。c 以托品酮为底物，5个TRI基因和2个突变体的体外活性离子色谱图。d和e 5种野生型 (d) 和5种突变型 (e) TRI基因的还原催化效率 ( ) 值。f 三个LS基因体内活性离子色谱图。

最后，通过在高山植物莨菪中莨菪碱和东莨菪碱合成通路下游基因LS、PPAR、CYP80F1、HDH和H6H基因的功能验证，我们确认了关键下游合成基因的功能丧失可能是在不合成该两种生物碱的茄科物种中发生了功能终止、基因假基因化和基因丢失相关的保守进化过程等，而这些基因在合成该两种生物碱物种中保留了其祖先的功能 (图4、图5、图7)。

图7 | PPAR、CYP80F1、HDH和H6H酶活性表征。a 三个物种PPAR基因体外活性离子色谱图。b 烟草中共表达CYP80F1和HDH基因体内活性离子色谱图。c 两个物种H6H基因体外活性离子色谱图。

综上所述，研究人员通过对四个高质量的茄科基因组的比较分析，证实了三个合成莨菪碱和东莨菪碱的物种（代表三个谱系分支--三个不同的族）具有较远的亲缘关系，不能构成一个单系分枝，且这三个物种具有共同的生物合成途径、合成莨菪碱和东莨菪碱。根据多个茄科高质量基因组微共线性分析以及代谢通路上多个关键基因的获得性和丢失性生化实验，阐明了茄科两种药用托品烷类生物碱的清晰进化格局和演化历史，即：两种生物碱的生物合成途径茄科起源时，就已经建立起来了；在茄科随后的多样化过程中，莨菪碱和东莨菪碱合成基因在不同谱系分支中、相关基因随机丢失、导致多个不相关的类群都不合成这两个重要的生物碱。对关键基因TRI的获得性和丢失性突变也表明，在不合成两种生物碱的谱系分支的代表性物种中，由于松弛进化带来的位点突变，其酶活性和功能进一步降低，并且导致基因序列的进一步丢失。

这一研究结果重大的启发价值在于：不合成两种重要生物碱的茄科作物中，如土豆、番茄、辣椒等物种中，还存在大量的合成两种生物碱生物途径的重要基因；功能减弱基因、假基因化基因以及少量丢失的基因，可以通过基因工程，改变或加入这些基因，从而在茄科作物中重建两种重要生物碱的完整合成通路，从而利用茄科作物大规模农业生产两种重要生物碱。

兰州大学生态学院2023届博士研究生杨娇、武颖、张攀、马健翔和四川大学生命学院博士生姚英俊为论文共同第一作者；刘建全教授为论文的通讯作者。该研究得到了第二次青藏高原科学考察与研究计划项目 (2019QZKK0502)、中国科学院战略重点研究计划 (XDB31000000)、甘肃省科技重点专项 (22ZD6NA007) 和中央高校基本科研业务费专项 等项目资助以及兰州大学超算中心提供的计算资源支持。

参考文献

[1] 仁真旺甲，何青秀，苏锦松等. 多基原藏药“唐冲”名称，品种，药性和植物亲缘关系相关性考证研究. 世界科学技术-中医药现代化, 2021, 23: 7.

[2] 罗达尚，夏光成. 青藏高原藏药资源简介. 中草药, 1984, 5: 3.

[3] Spinks A B, Wasiak J, Villanueva E V. Scopolamine (hyoscine) for preventing and treating motion sickness. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2011, 3: CD002851

[4] Capasso A, De Feo V, De Simone F, et al. Activity-directed isolation of spasmolytic (anticholinergic) alkaloids from Brugmansia arborea (L.) Lagerheim. Pharmaceutical Biology, 2008, 35: 43-48.

[5] 姚尚龙. 麻醉学过去，现在与未来. 皖南医学院学报, 2009, 28.

[6] Zhang, F. Y., et al. Revealing evolution of tropane alkaloid biosynthesis by analyzing two genomes in the Solanaceae family. Nat. Commun. 14, 1446 (2023).

[7] Griesmann, M. et al. Phylogenomics reveals multiple losses of nitrogen-fixing root nodule symbiosis. Science 361, 125 (2018).

[8] Wang, X. et al. High-quality evergreen azalea genome reveals tandem duplication-facilitated low-altitude adaptability and floral scent evolution. Plant Biotechnol. Journal 19, 2544-2560 (2021).

转自：“iPlants”微信公众号

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