样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

添加蛋白酶抑制剂。

目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

力

加大上样量或提高目标蛋白浓度。

转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

控制转膜时间并选择适合的转印膜。

一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

选用高品质抗体。

一抗反复使用后导致效价降低，尽管还能与目标蛋白连接，但连接蛋白的数量太

一抗不宜反复使用。

洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。

洗脱时间的时间和频率应有效控制，一般建议3次10分钟。

一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。

降低一抗浓度。

洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

提高洗脱时间和频率。

封闭物用量不足。

提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。

封闭物使用不当。

检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

封闭时间不够。

室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜。

一抗稀释度不适宜。

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

一抗孵育的温度偏高。

建议4℃结合过夜。

膜上其他部位与一 抗或二抗非特异性结合，配置的封闭液可能没有完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。

配置封闭液后最好静止一下，封闭牛奶一定要纯，封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。

抗体与封闭试剂反应。

使用前过滤封闭试剂。

HRP偶联二 抗中有聚集体。

过滤二抗试剂，去除聚集体。

一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

更换一抗。

目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

更换一抗品种。

蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。

添加蛋白酶抑制剂。

过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗，导致我们在做化学发光检测时，发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。

减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。

转膜时候，膜与胶之间有气泡。

制作“三明治”时，注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里，液体高度与第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇一些转膜液，把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上，随后在确认滤纸与胶之间无气泡后，再往胶上浇一些电转液，之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间，使膜成U型，再将U型底部接触到胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法，可以用玻璃棒贴实一下，然后盖上海绵垫。

这种情况很容易出现，因为导致条带拖尾的原因很多，可能性较大的是一抗浓度太高，作用时间太长或。

根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。

胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整。

配胶时用的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时避免大幅度动作触碰。

出现哑铃装条带的问题，最大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉淀在孔的中间，蛋白被挤到两边。

把胶配好，不合格的胶坚决不能用。

电泳电流不均一

换电泳槽，或者不使用两边的孔。

膜可能干过。

在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干掉，确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。

条带呈“微笑U”状，凝胶冷却不均一，电泳槽老化。

更换电泳槽。

条带呈“倒微笑∩”装，凝胶左右两头没有凝固好。

重新制胶。

蛋白分子量偏高或者偏低。

可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。

蛋白质降解。

蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。

所有条带连成一片没有间隔。

原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。