由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。

因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。

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必须满足抗体选择的基本条件

流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

｜多克隆抗体与单克隆抗体的比较

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注意荧光标记方式

流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

｜Bioswamp产品免疫荧光实验图

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流式抗体荧光标记的选择

如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。

以某仪器为例：PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。

FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道，流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。

常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

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同型对照的选择

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。

同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。

同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。

补充小建议

1.目标蛋白的物种千万不要搞错；

2.确认抗体的物种是小鼠、大鼠、兔子等，虽然现在荧光都标记好了，一般不需要二抗，但是最好还是选择你有匹配一抗的二抗，以备不时之需；

3.荧光颜色的选择，一定要是你的流式仪可以读出的，还要跟你需要的counterstain的其他流式抗体错开频率；

4.确定抗体的球蛋白亚型；

5.了解抗体可以测多少样品，可根据推荐的浓度计算下。

转自：“Super Lab”微信公众号

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