CRISPR-Cas系统是原核生物抵御病毒的一种获得性免疫系统，是sgRNA靶向和激活的核酸酶系统，可对靶向的DNA或RNA进行定向切割。CRISPR-Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为Class I和Class II两大家族（一型和二型）。单亚基效应物的Class II家族熟知的蛋白包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等。Class I家族包括Cascade-Cas3, Csm, Cmr复合物等等。

目前基于CRISPR-Cas的基因编辑技术已“花落千万家”，被广泛应用于基因校正，遗传育种、新药开发、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为“基因魔剪”，在后基因组时代遗传疾病精准治疗中被寄予厚望。但是这些技术不管是单碱基编辑器还是多基因敲除等技术都是围绕sgRNA靶向和RNA guided核酸酶展开的。如果能找到一种sgRNA介导的蛋白酶系统，可以实现对蛋白的定向切割，那将有开启精准医疗新的起点。

康奈尔大学的可爱龙实验室联合荷兰代尔夫特理工大学Stan J.J Brouns实验室，于8月25日在Science 杂志以长文形式发表了题为“Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA activated protease”的研究论文，该论文报道了Craspase（CRISPR偶联的蛋白酶新系统，CRISPR associated Caspase）是一个gRNA引导靶向，并且受到靶向RNA激活的蛋白酶，该蛋白酶受到激活之后可以对天然的蛋白底物进行切割并诱导细胞死亡。在精准医疗新时代背景下，该工具有望引领出全新的精准医疗思路。胡纯一博士等人，对Craspase进行了全方位的解析，通过结构比对，发现Craspase只有在结合non-matching PFS的RNA底物时才会发生巨大的构象变化，该类RNA底物可以通过non-matching的PFS的介导靶向RNA的3’端与开关螺旋switch heliex发生空间冲突，这会刺激这个开关螺旋进行重排和位移，而这种构象改变会以一种接力的方式最后引起蛋白酶活性中心的激活（图1）。

这些研究表明，该系统的蛋白酶活性调控十分严谨，需要同时满足至少三个条件。第一，目标RNA必须和guide RNA的引导区完全互补配对（至少18个碱基）。第二，guide RNA 5' tag位置的PFS区的前两位（-1和-2位置碱基）必须与目标RNA错配，与靶向互补配对。第三，靶向RNA的3'端除去前两位不能错配的碱基之外还需要额外至少3个碱基用来推动蛋白酶的开关螺旋进行重排变构，从而激活蛋白酶（图2）。

最后一个关键问题，这个蛋白酶切割什么样的底物？团队通过体内体外筛选，成功筛选到该Craspase系统蛋白酶底物，名为Csx30。该Craspase系统在结合了“非我”RNA（Non-matching PFS target）之后能快速特异性地对该蛋白底物进行切割。因此这个结果从生化水平非常确切地验证了该蛋白酶系统受到CRISPR系统的精准调控，最后成为靶向RNA激活的蛋白酶。此外，该团队还从结构出发，设计出了一些多肽序列，在体外也能在靶向RNA激活的情况下实现蛋白酶的精准切割。这在一定程度上暗示了该系统非常有潜力切割多重蛋白底物（图3），前景十分广大。

总之，这篇Science 论文，全面阐述了Craspase系统是如何通过门控环精准靶向RNA,并且靶向的RNA通过PFS位置再次进行选择，“非我”序列RNA会快速激活蛋白酶TPR-CHAT，并完成对蛋白底物的切割。因此这项精准调控的蛋白酶降解工具在未来有可能作为新的精准医疗工具，开启全新的靶向蛋白的治疗新思路。若能拓展出蛋白酶更多的底物多样性，未来有望与PROTAC技术赛跑。

转自：“iNature”微信公众号

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