实验原理

在生理状态下把细胞内的染色质DNA和与其结合的蛋白质固定交联在一起，通过超声或酶切法将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集DNA片段，再通过多种下游检测技术（qPCR、测序等）来检测此富集片段的DNA序列；ChIP实验主要应用于：组蛋白及组蛋白修饰的研究；DNA结合的转录因子的研究；转录辅助因子的研究。

实验步骤

细胞准备--对于HeLa细胞，约为1-2x107个细胞，获得的染色质可用于10次免疫沉淀实验 (根据细胞和实验类型而不同)

酶解法

(1)终浓度为1%甲醛室温交联10min，建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接；

(2)交联反应结束后加入甘氨酸终止反应；

(3)细胞刮刀收集细胞于离心管中。预冷后离心收集细胞并洗涤；

(4)收集到的细胞用Buffer A重悬，细胞膜核膜“打孔剂”以便核酸酶进入；

(5)离心收集细胞核沉淀，用Buffer B重悬（两次）；

(6)微球菌核酸酶消化染色质，37℃，20min；

(7)0.5M EDTA终止消化后，离心沉淀细胞核，并用ChIP buffer重悬；

(8)短暂超声（30%功率，20s，3次，每次大于30s间隔降温），彻底破坏细胞膜和核膜结构，让染色质得到完全释放；

(9)加入ChIP级抗体，孵育过夜，10ug染色质或者4×106个细胞可以做一次标准的ChIP

(10)加入Protein G磁珠，共孵育2h；

(11)3次低盐溶液漂洗，1次高盐溶液漂洗;

(12)洗脱ChIP染色质（65℃，30min），并解交联，2h 或者过夜解交联，Proteinase K处理消化蛋白质，释放DNA；

(13)利用DNA纯化柱进行ChIP DNA纯化。

超声法

(1)终浓度为1%甲醛室温交联10min，建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接；

(2)交联反应结束后加入甘氨酸终止反应；

(3)细胞刮刀收集细胞于离心管中，预冷后离心收集细胞并洗涤；

(4)每1-2×107细胞重悬于1ml ChIP细胞裂解液/超声缓冲液，冰上孵育10min；

(5)优化超声条件(超声后，进行核酸电泳，检测片段长度为200-1000bp，片段较长则再次超声)

(6)其余步骤同酶解法。

转自：“精英汇科研服务”微信公众号

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